本发明涉及一种快繁方法，尤其是一种山丹脱毒快繁方法，属于组织培养领域。
背景技术：
山丹（liliumpumilumdc.）为百合科百合属多年生草本植物，其株形秀丽、花瓣反卷、花色美丽娇艳，极具观赏价值，适宜成片种植于疏林下、草坪边，也可用于花坛、花境及盆栽观赏。同时，山丹还是重要的中药材，其地下鳞茎具有润肺止咳，清热安神、解渴润燥、防癌抗癌等功效，对虚劳咳嗽，吐血，虚烦，惊悸，浮肿等病症有良好疗效，在众多方剂中得到广泛应用。山丹由于其极强的抗寒、抗旱和耐盐碱特性，是观赏和食用百合种质创新的重要抗性来源材料。山丹由于其良好的观赏和药用价值，近年来野生资源被大量采挖，加之自然更新能力较弱，种群破坏严重，一些地区山丹已濒临灭绝。山丹由于其鳞茎小、繁育难度大、原生环境复杂多样，并且病毒感染率极高，使得种源开发和资源异地保存举步维艰。组织培养技术作为山丹资源保存和后续种源产业化开发唯一有效的途径逐渐受到人们的重视，但传统组织培养通常需要大量采挖山丹地下鳞茎作为外植体，而山丹鳞茎生长的土壤中存在大量的微生物，以鳞片为外植体时，由于携带大量真菌或细菌，在进行初代培养时污染率极高，成功率很低，并且大量采挖山丹鳞茎作为外植体，会加剧对野生山丹资源的破坏。同时，以鳞片为外植体获得的再生后代不能脱除病毒，随着繁殖世代增加，病毒不断积累，给山丹资源保护和后续种源开发带来毁灭性影响。前人研究表明，植物种子一般是不携带病毒的，那么作为未成熟种子的胚珠也可以确定是没有感染病毒的。基于上述现状，开发简单易行、并且对野生资源不造成破坏的山丹脱毒组培技术势在必行。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高效、低污染率的山丹脱毒快繁方法，本发明运用胚培养技术，以山丹授粉后充分膨大但尚未成熟的蒴果为材料，剥取蒴果内的胚珠（未成熟的种子），选择合适的培养基直接诱导形成初代无毒山丹试管苗。初代无毒山丹试管苗接种到合适的扩繁培养基上进行增殖。增殖后的试管苗转接到附加特定生长素的改良的ms培养基，在特定光周期下培育成重量不低于1g的大规格山丹试管生鳞茎。本发明提供的技术方案具体如下：一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基ms+naa上，促进萌发培养基ms+naa为ms+40-60g/l蔗糖+0.01-0.1mg/lnaa+6.5-7.0g/l琼脂粉，ph5.4-5.6；高温条件下高压灭菌15-20分钟；所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段，直接形成实生苗；步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总rna进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用rt-pcr对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；步骤（5）、试管苗扩繁：步骤（5）中病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基ms+kt+naa，扩繁培养基ms+kt+naa为ms+20-40g/l蔗糖+1.0-3.0mg/lkt+0.2-1mg/lnaa+6.5-7.0g/l琼脂粉，ph5.7-6.0，实现脱毒试管苗数量的增加；步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基。进一步地，步骤（2）中，用0.2-0.5%的洗洁精水浸泡10-20分钟，自来水下流水冲洗半小时以上；然后置于超净工作台上，先用浓度70-75%酒精浸泡60-100秒，并不断晃动，再用浓度1.5-2.5%的次氯酸钠溶液浸泡15-30分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗4-6次，每次不少于5分钟。进一步地，步骤（3）中，胚珠培养条件为：在温度25±1°c，光强12-20μmolm-2s-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。进一步地，步骤（5）中，培养条件为：在温度25±1°c，光强30-36μmolm-2s-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。进一步地，步骤（6）中，所述的小鳞茎膨大及生根培养基为改良ms培养基附加蔗糖40-50g/l、甘露醇20-30g/l和iaa0.3-1mg/l。进一步地，步骤（6）中，改良ms培养基成分及含量如表1所示：表1改良ms培养基成分及含量表我们收集授粉后充分膨大但尚未成熟的山丹蒴果，通过胚珠培养不但能够有效脱除病毒，获得大量脱毒山丹试管苗，而且污染率低，还不会对野生山丹造成破坏。组培小鳞茎的大小直接决定着山丹移栽成活率的高低，在组培过程中尽可能培育大规格的试管小鳞茎是保证山丹脱毒试管苗走向田间，实现规模化生产的关键因素。通过培养基主要营养元素、碳源、激素含量调整及光照条件优化，进行大规格山丹试管鳞茎培育。与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：（1）本发明以不携带病毒的山丹胚珠为培养材料，不经愈伤组织途径，直接诱导形成大量初代脱毒山丹试管苗，具有操作简单，培养周期短，脱毒率高等突出优点，从胚珠接种到萌发只需要40d左右的时间，脱毒率达到100%。同时，由于胚珠培养是由幼胚直接诱导形成完整植物，不容易引起基因变异。该过程以未成熟蒴果为外植体来源，无需采挖野生山丹鳞茎，避免对野生种群的破坏，也避免了以鳞片为外植体带来的严重的真菌及细菌污染问题，基本没有污染发生。（2）本发明进行胚珠培养时，通过适当增加蔗糖浓度，降低ph，使培养基的渗透压和ph更接近在蒴果中渗透压和ph，有利于胚珠萌发，萌发率达到95%以上，而采用常规蔗糖含量和ph值的培养基在相同激素含量和培养条件下萌发率仅为80%左右。（3）与正常培养光照强度和暗培养相比，本发明优化的光照强度能明显促进胚珠萌发，使胚珠萌发时间由50天以上缩短到40天左右，并且萌发率由70%左右增加到95%以上。（4）本发明以胚珠为外植体进行培养还具有如下有益效果：a、可以在短期内获得大量无毒试管苗。一株山丹一般可以形成4-5个硕果，平均每个蒴果可以剥取30-50个发育良好的胚珠，经40天左右的培养可以形成120-250个无毒试管苗，也就是说来源于一株山丹的胚珠经40天培养就可以获得120-250个无毒试管苗。而如果采用传统的茎尖培养脱毒，一株百合只能剥取一个茎尖，茎尖培养40-60天形成一块愈伤组织，愈伤组织经40-50天分化形成不超过10个再生试管苗，也就是说采用传统脱毒方式，一株百合经历80-100天才可获得不超过10个再生试管苗。b、脱毒效率高。以不感染病毒的胚珠为外植体，获得的试管苗100%是不感染病毒的。而采用传统茎尖培养脱毒技术，脱毒率一般不超过90%。c、污染率低。因为胚珠受到蒴果果皮的保护，不与外界接触，处于无菌状态，所以胚珠培养过程中污染率极低，接近零。而不管是茎尖培养还是鳞片培养，由于都源于鳞茎，而鳞茎与土壤密切接触，携带大量微生物，表面灭菌很难彻底消除所以微生物，所以感染率一般超过40%。（5）本发明以小鳞茎膨大及生根培养基成分优化，通过碳源种类、含量和比例优化及激素含量优化，加速了试管鳞茎膨大速率，提高了大规格试管鳞茎的比例，本申请的培养基培养120天时，山丹试管鳞茎的平均重量为0.76g，重量超过0.5g的大规格试管鳞茎占91.3%，重量超过1.0g试管鳞茎超过50%。而传统培养基在相同培养条件下，试管鳞茎的平均重量为0.45g，重量超过0.5g的大规格试管鳞茎占22.7%，没有出现重量超过1.0g的试管鳞茎。具体实施方式下面将结合实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本实施例的山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于4℃低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：经步骤（1）取得的山丹蒴果用0.3%的洗洁精水浸泡10分钟，自来水下流水冲洗半小时；然后置于超净工作台上，先用浓度75%酒精浸泡60秒，并不断晃动，再用浓度2.0%的次氯酸钠溶液浸泡15分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗4次，每次不少于5分钟；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果置于无菌滤纸上吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，用无菌镊子接种到促进萌发培养基ms+naa上，于25±1°c、12μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天16小时光照，8小时黑暗；所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段；促进萌发培养基ms+naa为ms+50g/l蔗糖+0.05mg/lnaa+6.5g/l琼脂粉，ph5.4，121℃下高压灭菌20分钟。步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总rna进行反转录，以反转录产物为模板，根据侵染山丹的三种主要病毒黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用rt-pcr对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明试管苗没有感染病毒。根据genbank中公布的黄瓜花叶病毒（cmv）、百合隐症病毒（lsv）、百合斑驳病毒（lmov）外壳蛋白编码基因序列分别设计pcr引物，序列如下：rna提取采用transzolplant试剂盒进行，具体操作如下：1、将40mg试管苗叶片放入液氮预冷的研钵，加入少量液氮，迅速研磨成粉末状，转移到无rnase的离心管中，然后加入0.5mltpi溶液。2、涡旋混匀后，12000×g离心管5分钟。3、吸取上清，转移到新的无rnase离心管中。4、向转移的上清中加入0.5mltpii溶液，颠倒混匀数次，加入1/4上清体积的氯仿，混匀后室温放置5分钟。5、12000×g离心5分钟，然后小心吸取上清。6、加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。7、12000×g离心10分钟，弃上清，管底有rna沉淀。8、加入1ml75%乙醇，涡旋。9、10000×g离心5分钟，弃上清，室温晾干。10、加入30μl无rnase的水溶解沉淀后备用。采用primescript™ii1ststrandcdnasynthesiskit对提取的百合rna进行反转录，具体操作如下：1、在microtube中配制一下反应混合液random6mers1μldntpmixture1μl模板rna3μlrnasefreedh2o5μl2、65°c保温5分钟，冰上迅速冷却。3、在上述microtube中配制下列反转录反应液上述变性后反应液10μl5×primescriptiibuffer4μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.5μlprimescriptiirtase(200u/μl)1μlrnasefreedh2o4.5μl4、缓慢混匀后30℃温育10分钟5、95℃处理5分钟，然后冰上冷却。pcr采用2×easytaq®pcrsupermix，pcr反应体系如下：水（nuclease-free）22μl正向引物1μl反向引物1μl2×easytaq®pcrsupermix25μl模板（反转率产物）1μlpcr程序为：94°c预变性4分钟，94°c变性30秒，53°c退火30秒，72°c延伸30秒，30个循环后，72°c最终延伸分钟。pcr结束后，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，出现相应条带的为阳性，感染病毒；未出现相应条带的为阴性，不感染病毒。步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基ms+kt+naa，于25±1°c、36μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天16小时光照，8小时黑暗，实现脱毒试管苗数量的增加；扩繁培养基ms+kt+naa具体为ms+30g/l蔗糖+1.5mg/lkt+0.2mg/lnaa+6.5g/l琼脂粉，ph5.7。步骤（6）、试管鳞茎茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基，鳞茎膨大及生根培养基为改良ms培养基附加蔗糖40g/l、甘露醇20g/l和iaa0.3mg/l。改良ms培养基成分及含量如表2所示：表2改良ms培养基成分及含量表成分使用浓度(mg/l)硝酸钾 kno33800磷酸二氢钾 kh2po4340硫酸镁 mgso4·7h2o370氯化钙 cacl2·2h2o880碘化钾 ki0.83硼酸 h3bo36.2硫酸锰 mnso4·4h2o22.3硫酸锌 znso4·7h2o8.6钼酸钠 na2moo4·2h2o0.25硫酸铜 cuso4·5h2o0.025氯化钴 cocl2·6h2o0.025乙二胺四乙酸二钠 na2.edta37.25硫酸亚铁 feso4·7h2o27.85肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 vb10.1盐酸吡哆醇 vb60.5烟酸 vb5或vpp0.5该培养基在促进试管鳞茎膨大的同时，也能形成良好根系。本实施例中所用的培养器皿为容积为370ml的组培瓶，含培养基体积为40ml。本实施例的ms培养基成分及含量如表3所示：表3ms培养基成分及含量成分使用浓度(mg/l)硝酸钾 kno31900硝酸铵 nh4no31650磷酸二氢钾 kh2po4170硫酸镁 mgso4·7h2o370氯化钙 cacl2·2h2o440碘化钾 ki0.83硼酸 h3bo36.2硫酸锰 mnso4·4h2o22.3硫酸锌 znso4·7h2o8.6钼酸钠 na2moo4·2h2o0.25硫酸铜 cuso4·5h2o0.025氯化钴 cocl2·6h2o0.025乙二胺四乙酸二钠 na2.edta37.25硫酸亚铁 feso4·7h2o27.85肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 vb10.1盐酸吡哆醇 vb60.5烟酸 vb5或vpp0.5实施例2本实施例的山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于4℃低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：经步骤（1）取得的山丹蒴果用0.2%的洗洁精水浸泡20分钟，自来水下流水冲洗半小时；然后置于超净工作台上，先用浓度70%酒精浸泡100秒，并不断晃动，再用浓度1.5%的次氯酸钠溶液浸泡20分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗5次，每次不少于5分钟；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果置于无菌滤纸上吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，用无菌镊子接种到促进萌发培养基ms+naa上，于25±1°c、20μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天10小时光照，10小时黑暗；所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段；促进萌发培养基ms+naa为ms+40g/l蔗糖+0.03mg/lnaa+7.0g/l琼脂粉，ph5.6，121℃下高压灭菌15分钟。步骤（4）、组培苗病毒检测：该步骤与实施例1相同。步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基ms+kt+naa，于25±1°c、30μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天10小时光照，14小时黑暗，实现脱毒试管苗数量的增加；扩繁培养基ms+kt+naa具体为ms+20g/l蔗糖+1.0mg/lkt+0.5mg/lnaa+7.0g/l琼脂粉，ph6.0。步骤（6）、试管鳞茎茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基，鳞茎膨大及生根培养基为改良ms培养基附加蔗糖50g/l、甘露醇30g/l和iaa1mg/l。改良ms培养基成分及含量如表4所示：表4改良ms培养基成分及含量表成分使用浓度(mg/l)硝酸钾 kno32850磷酸二氢钾 kh2po4255硫酸镁 mgso4·7h2o370氯化钙 cacl2·2h2o660碘化钾 ki0.83硼酸 h3bo36.2硫酸锰 mnso4·4h2o22.3硫酸锌 znso4·7h2o8.6钼酸钠 na2moo4·2h2o0.25硫酸铜 cuso4·5h2o0.025氯化钴 cocl2·6h2o0.025乙二胺四乙酸二钠 na2.edta37.25硫酸亚铁 feso4·7h2o27.85肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 vb10.1盐酸吡哆醇 vb60.5烟酸 vb5或vpp0.5该培养基在促进试管鳞茎膨大的同时，也能形成良好根系。本实施例中所用的培养器皿为容积为370ml的组培瓶，含培养基体积为40ml。本实施例的ms培养基成分及含量与实施例1相同。实施例3本实施例的山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于4℃低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：经步骤（1）取得的山丹蒴果用0.5%的洗洁精水浸泡13分钟，自来水下流水冲洗半小时；然后置于超净工作台上，先用浓度75%酒精浸泡100秒，并不断晃动，再用浓度2.5%的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗6次，每次不少于5分钟；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果置于无菌滤纸上吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，用无菌镊子接种到促进萌发培养基ms+naa上，于25±1°c、20μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天16小时光照，8小时黑暗；所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段；促进萌发培养基ms+naa为ms+60g/l蔗糖+0.01mg/lnaa+6.8g/l琼脂粉，ph5.6，121℃下高压灭菌18分钟。步骤（4）、组培苗病毒检测：该步骤与实施例1相同。步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基ms+kt+naa，于25±1°c、33μmolm-2s-1弱光培养条件下培养，每天12小时光照，10小时黑暗，实现脱毒试管苗数量的增加；扩繁培养基ms+kt+naa具体为ms+40g/l蔗糖+3.0mg/lkt+1mg/lnaa+6.8g/l琼脂粉，ph6.0。步骤（6）、试管鳞茎茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基，鳞茎膨大及生根培养基为改良ms培养基附加蔗糖45g/l、甘露醇25g/l和iaa0.5mg/l。改良ms培养基成分及含量如表5所示：表5改良ms培养基成分及含量表成分使用浓度(mg/l)硝酸钾 kno33500磷酸二氢钾 kh2po4320硫酸镁 mgso4·7h2o370氯化钙 cacl2·2h2o750碘化钾 ki0.83硼酸 h3bo36.2硫酸锰 mnso4·4h2o22.3硫酸锌 znso4·7h2o8.6钼酸钠 na2moo4·2h2o0.25硫酸铜 cuso4·5h2o0.025氯化钴 cocl2·6h2o0.025乙二胺四乙酸二钠 na2.edta37.25硫酸亚铁 feso4·7h2o27.85肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 vb10.1盐酸吡哆醇 vb60.5烟酸 vb5或vpp0.5该培养基在促进试管鳞茎膨大的同时，也能形成良好根系。本实施例中所用的培养器皿为容积为370ml的组培瓶，含培养基体积为40ml。本实施例的ms培养基成分及含量与实施例1相同。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表：<120>一种山丹脱毒快繁方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工合成序列<400>1ctttgtagggagtgaacgctgta23<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>2agatggcggcaacggata18<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成序列<400>3tatgggcttccaatacaac19<210>4<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>4tattcggtttccaggttc18<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>5tccaggcaaatgagacactc20<210>6<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>6gctagattgaagtcggtgaga21序列表<120>一种山丹脱毒快繁方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工合成序列()<400>1ctttgtagggagtgaacgctgta23<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成序列()<400>2agatggcggcaacggata18<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成序列()<400>3tatgggcttccaatacaac19<210>4<211>18<212>dna<213>人工合成序列()<400>4tattcggtttccaggttc18<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成序列()<400>5tccaggcaaatgagacactc20<210>6<211>21<212>dna<213>人工合成序列()<400>6gctagattgaagtcggtgaga21当前第1页12