本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别涉及植物愈伤组织的诱导培养基和植物干细胞的制备方法。
背景技术：
药用植物是指医学上用于防病、治病的植物。其植株的全部或一部分供药用或作为制药工业的原料。广义而言，可包括用作营养剂、某些嗜好品、调味品、色素添加剂，及农药和兽医用药的植物资源。药用植物种类繁多，其药用部分各不相同。如郁金香为百合科郁金香属多年生草本植物，具有化湿辟秽的功效，主脾胃湿浊、胸脘满闷、呕逆腹痛、口臭苔腻。有报导显示，郁金香的花和叶中含一种有毒生物碱，其生理作用类似西发丁碱(veratrine)，郁金香甙abc对枯草杆菌有抑制作用。茎和叶的酒精提取液对bacilluscereusmycoides有抗菌作用，其活性成分中含有多种氨基酸。但药用植物生长缓慢、活性成分含量低，致使活性化合物的来源难以保障，难以适应工业化生产的需求。随着科技的发展，植物生物技术在农业及国民经济中的应用日益广泛，植物组织培养和转基因技术已成为改良作物和提高产量的重要基础。以体外再生为基础的植物离体快速繁殖技术为重要经济作物和资源植物的保存和产业化提供技术保证。一些重要农作物和经济植物难于实现外源基因的转化和快速繁殖的主要原因是植物细胞全能性及命运控制问题。开展植物细胞全能性和命运控制机制的研究将从根本上阐明植物的再生机制，提高作物的再生能力，为推动农业生物技术的产业化发展打下科学的基础。植物干细胞又称为分生组织，是相对于植物体内已经分化的成熟组织而言的，是植物体内未分化的细胞。植物分生组织根据其位置可以分为顶端分生组织和侧生分生组织两大类。其中顶端分生组织包括茎尖分生组织(shootapicalmeristem，sam)和根尖分生组织(rootapicalmeristem，ram)；侧生分生组织包括维管形成层(vascularcambium)和木栓形成层(corkcambium)。植物干细胞是生长发育的源泉和信号调控中心。它是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续分裂能力。植物干细胞还可以通过自我凋亡防止遗传性损伤，避免将有缺陷的dna遗传下去，从而保护植物不受恶劣环境的影响。植物干细胞的维持依赖于两个重要因子wuschel(简称：wus)和clavata3(clv3)之间形成的负反馈调节环。wus是第一个被发现的调控植物干细胞的重要分子，wus基因的突变将导致生长点的干细胞进入分化状态。wus蛋白从其表达的组织中心移动至干细胞所在的中央区通过诱导clv3基因的表达以维持干细胞的细胞属性。clv3基因编码一种可分泌的多肽类激素，它通过与受体clv1和clv2、coryne(crn)的结合反过来限制wus基因表达的区域，从而维持了干细胞数目的稳定。这个负反馈调节环作为茎尖生长点核心调控机制维持了茎尖生长点的动态平衡。最近的研究表明激素对于茎尖干细胞的维持起重要的调控作用。目前，植物干细胞培养主要有3个步骤：(1)从植物中获得含有形成层的组织；(2)将含有形成层的组织在培养基中培养；(3)从形成层中分离细胞，从而获得形成层来源的干细胞。然而，现有的植物干细胞培养生长周期慢，数量不能满足生产需求。而且植物细胞培养经历一个脱分化过程，在这个过程中会发生体细胞突变，导致细胞系遗传稳定性降低。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了植物愈伤组织的诱导培养基和植物干细胞的制备方法。本发明是利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，在传统细胞培养的基础上，以干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，较短时间内分离出数量较多的、遗传稳定性好的干细胞，为建立相应的干细胞体系打下基础。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种植物愈伤组织的诱导培养基，包括如下组分：作为优选，该诱导培养基包括如下组分：在本发明提供的另一具体实施例中，该诱导培养基包括如下组分：在本发明提供的另一具体实施例中，该诱导培养基包括如下组分：作为优选，基础培养基为ms完全培养基。本发明还提供了一种植物干细胞的制备方法，包括如下步骤：将外植体接种于本发明诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；将愈伤组织与水解酶消化液混合，消化，离心，保留沉淀物；将沉淀物进行清洗、离心，去掉上清液，得到植物干细胞。作为优选，诱导培养的温度为2～8℃，时间为5～6周。在本发明提供的一具体实施例中，诱导培养的温度为4℃，时间为5周。作为优选，外植体为0.5～1.0cm2大小的方块。作为优选，水解酶消化液为纤维素水解酶消化液和果胶水解酶消化液的混合物。作为优选，纤维素水解酶消化液中纤维素水解酶的浓度为1wt％～5wt％，果胶水解酶消化液中果胶水解酶的浓度为0.1wt％～0.7wt％。在本发明提供的一具体实施例中，水解酶消化液中，纤维素水解酶的浓度为2.5wt％，果胶水解酶的浓度为0.5wt％。作为优选，纤维素水解酶消化液与果胶水解酶消化液的体积比为(1.5～2):1。在本发明提供的一具体实施例中，纤维素水解酶消化液与果胶水解酶消化液的体积比为1.5:1。作为优选，消化的时间为50～70min。在本发明提供的一具体实施例中，消化的时间为60min。在本发明提供的实施例中，外植体为郁金香外植体。作为优选，郁金香外植体为郁金香最里层鳞片。在本发明提供的实施例中，郁金香外植体的制备方法为：取郁金香的鳞茎，剥去郁金香鳞茎最外层表皮，取最里层鳞片用水冲洗10min，水洗4～5次，然后用无菌水洗2次，75％酒精浸泡30s，无菌水洗2次，新洁尔灭溶液清洗3min，无菌水清洗4次。将灭菌好的鳞片剪成0.5～1.0cm2大小的方块。在本发明提供的实施例中，离心的转速为250g，时间为10min。本发明提供了植物愈伤组织的诱导培养基和植物干细胞的制备方法。该诱导培养基包括如下组分：2,4-d：0.4～0.8mg/l；naa：0.1～0.5mg/l；6-ba：1.5～2.5mg/l；基础培养基：补足。本发明至少具有如下优势之一：1、本发明将2,4-d、naa、6-ba添加入基础培养后，可快速诱导愈伤组织的形成；2、本发明干细胞制备方法是利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，以2,4-d、naa、6-ba组合诱导外植体，再采用纤维素水解酶和果胶水解酶消化愈伤组织，较短时间内分离出数量较多的、遗传稳定性好的干细胞，该方法能保持郁金香等植物干细胞的干性，确保后续的细胞生长基因稳定，且不受外界环境的影响，为建立相应的干细胞体系打下基础。具体实施方式本发明公开了植物愈伤组织的诱导培养基和植物干细胞的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。术语解释：郁金香(tulipagesnerianal.)为百合科郁金香属多年生草本植物，是春季重要的球根花卉，原产地中海沿岸、中亚西亚及土耳其等地，我国新疆和西藏也有部分原产。郁金香为多年生球根花卉，地下鳞茎的形态在冬季可以安全越冬，四月中旬开花，夏季休眠。郁金香种球形状似圆锥，有一短缩茎(鳞茎盘)上着生2-6层圆锥形的鳞片相套抱合而成圆锥形的鳞茎球，球体大小不等，大的鳞茎球一般5-6层鳞片，重量30-40克，直径3.0-4.5cm，最重可达45克，鳞茎为白色无味，每层鳞片有两层表皮，靠内侧的称为内表皮，靠外侧的称为外表皮，表皮可剥下，为无色透明状。刚收获的鳞茎球鳞片紧紧抱合，而播种时鳞茎层间有一定的间隙，大多为0.1cm左右，在最外层有一层黑褐色革质保护层，在其内侧覆盖一层黄褐色绒毛。parade品种郁金香：属于达尔文杂种系，植株健壮，株高50-70cm，花茎较长，单瓣花，花大，高脚杯状，适应性、繁殖力极强，是优良的品种。ms完全培养基：是无机盐和离子浓度较高，较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要。2,4-d：2,4-dichlorophenoxy，是一种人工合成的植物激素具有与生长素(iaa)相似的生理效应。用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用的生长素类似物的一种。naa：萘乙酸(1-naphthylaceticacid)，简称naa，是一种有机化合物，是一种易溶于有机溶剂的无色固体。它的结构为萘的1号位置以羧甲基取代。它是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。6-ba：6-苄氨基腺嘌呤，别名6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，6-ba具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，因而被广泛采用，并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。ba的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。本发明提供的植物愈伤组织的诱导培养基和植物干细胞的制备方法中所用试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1获取郁金香的愈伤组织取parade品种郁金香的鳞茎，剥去郁金香鳞茎最外层表皮，取最里层鳞片用自来水冲洗10min，纯净水洗4-5次，放入超净工作台中。然后用无菌水洗2次，75％酒精浸泡30s，无菌水洗2次，新洁尔灭溶液清洗3min，无菌水清洗4次。将灭菌好的鳞片用灭菌的剪刀剪成0.5-1.0cm2大小的方块。加入添加了外源刺激素的ms完全培养基(诱导愈伤组织生长的培养基)，具体配方见表1，置于2℃中生长5-6周，每周观察愈伤组织的生长情况。当生长出颜色为鹅黄色，不规则瘤状的愈伤组织，即愈伤组织诱导成功。表1ms完全培养基(1l诱导愈伤组织生长)名称含量2,4-d0.4mg/lnaa0.1mg/l6-ba1.5mg/l注：2,4-d、naa为生长素，6-ba为细胞分裂素。实施例2获取郁金香的愈伤组织取parade品种郁金香的鳞茎，剥去郁金香鳞茎最外层表皮，取最里层鳞片用自来水冲洗10min，纯净水洗4-5次，放入超净工作台中。然后用无菌水洗2次，75％酒精浸泡30s，无菌水洗2次，新洁尔灭溶液清洗3min，无菌水清洗4次。将灭菌好的鳞片用灭菌的剪刀剪成0.5-1.0cm2大小的方块。加入添加了外源刺激素的ms完全培养基(诱导愈伤组织生长的培养基)，具体配方见表2，置于4℃中生长5-6周，每周观察愈伤组织的生长情况。当生长出颜色为鹅黄色，不规则瘤状的愈伤组织，即愈伤组织诱导成功。表2ms完全培养基(1l诱导愈伤组织生长)名称含量2,4-d0.6mg/lnaa0.3mg/l6-ba2.0mg/l注：2,4-d、naa为生长素，6-ba为细胞分裂素。实施例3获取郁金香的愈伤组织取parade品种郁金香的鳞茎，剥去郁金香鳞茎最外层表皮，取最里层鳞片用自来水冲洗10min，纯净水洗4-5次，放入超净工作台中。然后用无菌水洗2次，75％酒精浸泡30s，无菌水洗2次，新洁尔灭溶液清洗3min，无菌水清洗4次。将灭菌好的鳞片用灭菌的剪刀剪成0.5-1.0cm2大小的方块。加入添加了外源刺激素的ms完全培养基(诱导愈伤组织生长的培养基)，具体配方见表3，置于8℃中生长5-6周，每周观察愈伤组织的生长情况。当生长出颜色为鹅黄色，不规则瘤状的愈伤组织，即愈伤组织诱导成功。表3ms完全培养基(1l诱导愈伤组织生长)名称含量2,4-d0.8mg/lnaa0.5mg/l6-ba2.5mg/l注：2,4-d、naa为生长素，6-ba为细胞分裂素。对比例1诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有0.6mg/l2,4-d的ms完全培养基。对比例2诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有0.3mg/lnaa的ms完全培养基。对比例3诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有2.0mg/l6-ba的ms完全培养基。对比例4诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有0.6mg/l2,4-d+0.3mg/lnaa的ms完全培养基。对比例5诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有0.6mg/l2,4-d+2.0mg/l6-ba的ms完全培养基。对比例6诱导愈伤组织的方法步骤同实施例2，所用诱导愈伤组织生长的培养基为含有0.3mg/lnaa+2.0mg/l6-ba的ms完全培养基。试验例1采用实施例1-3和对比例1-6的试验方法诱导郁金香的愈伤组织生长，每种培养基诱导10例，统计5周后的出愈率，试验结果见表4：表4诱导培养基效果对比结果显示，实施例1-3出愈率在50％-70％之间，对比例1-6出愈率在0-30％，证明实施例中的3种激素组合效果最好。实施例4提取郁金香干细胞取实施例1-3诱导成功的愈伤组织，加入1.0-4.0ml2.5％纤维素水解酶和1.5-5.0ml0.5％果胶水解酶共同消化60min，然后250g离心10min，去掉上清，保留底部沉淀物。拿10mlms基础培养基重悬清洗一次，再次250g离心10min，去掉上清液，获得郁金香干细胞。酶解组合1：1.5ml2.5％纤维素水解酶+2.0ml0.5％果胶水解酶酶解组合2：2.0ml2.5％纤维素水解酶+3.0ml0.5％果胶水解酶酶解组合3：3.0ml2.5％纤维素水解酶+4.5ml0.5％果胶水解酶酶解组合4：1.0ml2.5％纤维素水解酶+3.0ml0.5％果胶水解酶酶解组合5：4.0ml2.5％纤维素水解酶+3.0ml0.5％果胶水解酶酶解组合6：2.0ml2.5％纤维素水解酶+1.5ml0.5％果胶水解酶酶解组合7：2.0ml2.5％纤维素水解酶+5.0ml0.5％果胶水解酶试验例2郁金香干细胞质量鉴定对实施例4中各组分离完成后的郁金香干细胞进行wus基因rt-pcr定量检测，检查细胞的干性。ct值越低，证明基因含量越高，wus基因含量越高证明干性越高。试验结果见表5：表5wus基因rt-pcr定量检测结果结果显示，使用组合1-3能获得高干性的细胞，组合4-7仅能得到极低性干细胞的细胞，组合1-3的两种酶的使用量效果最好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12