一种千里香愈伤组织的诱导方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，具体地，涉及一种千里香愈伤组织的诱导方法。

背景技术：

千里香(murrayapaniculata(l.)jack.)为芸香科(rutaceae)九里香属(murraya)植物，又叫黄金桂、四季青、青木香等，产台湾、福建、广东、广西等地。千里香是著名中成药“三九胃泰”的主要原料之一，2015年版《中国药典》收载的中药材九里香植物来源为九里香m.exotical.和千里香m.paniculata(l.)jack.，二者的叶和带叶嫩枝作为九里香入药，具消肿止痛、活血散瘀之功效。实际上三九胃泰颗粒及胶囊使用的九里香药材均来源于千里香的叶片和带叶的嫩枝。

目前关于千里香的研究大多数集中在化学成分研究及药理研究上，有关实验证明千里香不仅具有镇痛的药理作用，且具有抗着床、抗菌消炎、麻醉、降血糖、增强机体免疫力等作用，是极具开发前景的药用植物。千里香入药部位为地上部分枝条，一般种植3年之后方可采收入药，由于采收的是地上部分枝条，第一年采收后第二年产量降低，因此为获得大量原料，需大量种植，才能满足生产上的需求。而千里香的繁殖方式目前主要以种子繁殖为主，千里香在野生状态下存在开花少，导致结实率低的现象，因而靠种子繁殖其繁殖系数太小，无法满足大生产的需求。

植物的组织培养技术在种质种苗的繁育运用已经非常的成熟，其具有繁殖系数大、速度快的特点，已经成为种苗繁育最为常用的技术手段。千里香通过愈伤组织诱导，不仅可以为下一步的再生成苗提供基础，也可以为后续愈伤组织大规模培养，提取有效物质如月橘烯碱、九里香黄酮等有效成分提供良好的途径。另外，千里香与其他柑橘属植物进行细胞融合培育抗病植株也需要通过愈伤组织培育成完整植株这一途径。因此，研究一种能提高千里香愈伤组织诱导率、降低其愈伤组织褐化率的诱导培养体系和条件是目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种千里香叶片愈伤组织的诱导培养基，采用该诱导培养基进行叶片愈伤组织诱导培养，叶片愈伤组织的诱导率相对较高，且叶片后期愈伤组织的褐化率较低。

本发明的另一目的在于提供一种千里香根段愈伤组织的诱导培养基，采用该诱导培养基进行根段愈伤组织诱导培养，根段愈伤组织的诱导率相对较高，且后期根段愈伤组织的褐化率较低。

本发明的另一目的在于提供一种千里香愈伤组织的诱导方法，采用该方法后千里香愈伤组织的诱导率高、褐化率低，且后续增殖继代培养不受影响。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明通过研究发现，2,4-d、6-ba和naa对诱导获得的千里香愈伤组织影响显著，当外植体来源不同时，千里香愈伤组织诱导培养基的最佳配方也是不同的。本发明以千里香成熟种子培育得到的无菌苗叶片及根段为实验材料，通过正交设计得到18个配方进行愈伤组织的诱导，探讨当外植体来源不同时，千里香愈伤组织诱导培养基的最佳配方。

结果表明：(1)叶片为外植体：生长素为2,4-d时，愈伤组织出现时间早，但是当2,4-d浓度过高，愈伤组织出现褐化的情况明显；生长素为naa时，愈伤组织出现时间晚，诱导率相对来说也比较低，但是后期愈伤组织的褐化率较低。本次试验中，愈伤组织诱导率最高的为2号配方ms+2,4-d0.5mg/l+6-ba0.5mg/l。(2)根段为外植体：愈伤组织诱导率最高的为17号配方ms+naa3.0mg/l+6-ba0.5mg/l，诱导率达100％，后期褐化率为0。

因此，本发明请求保护一种千里香叶片愈伤组织的诱导培养基，所述诱导培养基是含有0.5～1.0mg/l2,4-d和0.5～1.0mg/l6-ba的ms基本培养基。

优选地，所述诱导培养基是含有0.5mg/l2,4-d和0.5mg/l6-ba的ms基本培养基。

本发明还请求保护一种千里香根段愈伤组织的诱导培养基，所述诱导培养基是含有2.0～3.0mg/lnaa和0.3～1.0mg/l6-ba的ms基本培养基。

优选地，所述诱导培养基是含有2.0～3.0mg/lnaa和0.3～0.5mg/l6-ba的ms基本培养基。

更优选地，所述诱导培养基是含有3.0mg/lnaa和0.5mg/l6-ba的ms基本培养基。

本发明还请求保护一种千里香愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

s1.材料的预处理：将千里香成熟种子先用75％乙醇溶液消毒1～2min，再用含有吐温20的升汞消毒6～12min，将消毒后的种子去除种皮，接种到ms基本培养基中培养成无菌苗；

s2.愈伤组织的诱导：将无菌苗的叶片作为外植体接种于上述诱导培养基上培养至长出愈伤组织；或将无菌苗的根段作为外植体接种于上述诱导培养基上培养至长出愈伤组织。

优选地，步骤s1和s2中所述培养的条件为温度23～25℃，空气相对湿度50～70％，光强1500～2000lx，光照时间12h/d。

优选地，步骤s1中所述75％乙醇溶液的消毒时间为1min，升汞的消毒时间为8min。

优选地，步骤s1中所述吐温20与升汞的体积比为1：1000。所述吐温20可以提高消毒效率。

优选地，步骤s1中所述升汞的质量分数为0.1％。

作为一种可选择的具体实施方案，所述千里香愈伤组织的诱导方法，包括以下具体步骤：

s1.材料的预处理：在超净工作台上，将千里香成熟种子先用75％乙醇溶液消毒1min，再用含有吐温20的0.1％hgcl2溶液消毒8min，吐温20：hgcl2溶液(v/v)＝1：1000，无菌水漂洗6遍，每次3min；经消毒后的种子放到灭菌的带盖组培瓶中备用，每次接种前将消毒好的种子放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干材料表面的水分，用镊子和手术刀去除种皮，然后接种到ms基本培养基中培养成无菌苗；

s2.愈伤组织的诱导：在超净工作台内将无菌苗取出，然后用剪刀将叶片及根剪下备用；无菌苗叶片在培养皿中剪成0.5cm×0.5cm的小片后接种到愈伤组织诱导培养基上培养至长出愈伤组织；千里香无菌苗的根在培养皿中剪去多余的须根后，再剪成约1cm的根段接种到愈伤组织诱导培养基中上培养至长出愈伤组织；所述培养的条件为温度23～25℃，空气相对湿度50～70％，光强1500～2000lx。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以无菌苗的叶片或根段作为外植体，分别提供了适合于叶片或根段愈伤组织的诱导培养基，能在提高千里香愈伤组织诱导率的同时降低其褐化率，且不影响愈伤组织后续增殖继代培养，可应用于千里香种苗繁育、多倍体诱导、突变诱导以及转基因种质创新。本发明所提供的诱导方法与传统繁殖方法相比，具有操作简便，成本低的优点。

附图说明

图1为千里香果实、种子图片；其中，a、b为果实，c、d为种子。

图2为千里香种子接种后的萌发过程。

图3为千里香无菌苗叶片愈伤组织诱导情况；其中，数字1～18表示表3中培养基配方编号。

图4为千里香无菌苗根段愈伤组织诱导情况；其中，数字1～18表示表4中培养基配方编号。

图5为千里香无菌苗叶片愈伤组织继代增殖培养情况；其中，数字1～18表示由表3中培养基配方1～18诱导出的愈伤组织编号。

图6为千里香无菌苗根段愈伤组织继代增殖培养情况；其中，数字1～18表示由表4中培养基配方1～18诱导出的愈伤组织编号。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

千里香无菌苗叶片及根：试验材料来源为种子萌发的无菌苗叶片及根，种子由华润三九医药有限公司提供，采摘于2016年10月广西千里香种植基地。

培养基的制备和培养条件：根据试验设计，以ms基本培养基，并根据需要添加不同浓度的naa、2,4-d、6-ba等植物生长调节物质，琼脂粉8g/l，蔗糖30g/l，用1mol/l的hcl和naoh将培养基ph调到5.8～6.0，煮沸，待琼脂融化后，分装到组培瓶中，在121℃下高压灭菌25min，取出待用。

培养条件均为：日光灯照明，培养温度为23～25℃，空气相对湿度50～70％，光照时间12h/d，光强为1500～2000lx。

数据统计与分析：用excel2007进行数据处理和作图，spss20方差分析软件进行数据分析。

染菌率(％)＝染菌的种子数/接种的种子数×100％

萌发率(％)＝萌发的种子数/未污染的种子数×100％

褐化率(％)＝褐化的外植体数/接种的外植体块×100％

愈伤组织诱导率(％)＝出现愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100％

实施例1不同消毒时间对种子消毒结果的影响

在超净工作台上，将千里香成熟种子先用75％乙醇溶液消毒1min，再用含有吐温20的0.1％hgcl2溶液消毒6～12min，吐温20：hgcl2溶液(v/v)＝1：1000，无菌水漂洗6遍，每次3min；经消毒后的种子放到灭菌的带盖组培瓶中备用，每次接种前将消毒好的种子放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干材料表面的水分，用镊子和手术刀去除种皮，然后接种到ms基本培养基中。每个处理接至少15瓶，每瓶接2颗种子，重复3次。接种后20d统计污染率及种子萌发率，比较各种处理的消毒效果及对种子萌发的影响。

千里香果实和种子的图片如图1所示，种子接种后的萌发过程如图2所示。种子接种20d后，统计各消毒处理种子的染菌率，种子萌发率，用spss20进行方差分析，其结果见表1。

表1不同消毒方法对千里香种子消毒的影响

注：同一列中字母相同表示在0.05水平上无显著差异

由表1的结果可知，千里香种子四种消毒方式其染菌率没有差异，但种子萌发率之间是有显著差异，当75％乙醇1min+hgcl28min(滴加吐温)时种子萌发率最高，与其他3种方法之间有显著差异，因此千里香成熟种子的最佳消毒方式为75％乙醇消毒1min+0.1％hgcl2消毒8min(滴加吐温)。

实施例2不同激素种类浓度对千里香愈伤组织诱导的影响

诱导愈伤组织的外植体为无菌苗叶片、根段。选用细胞分裂素6-ba(0.3mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l)、生长素2,4-d(0.5mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l)与naa(1.0mg/l、2.0mg/l、3.0mg/l)为愈伤组织诱导激素，分别以6-ba与naa、6-ba与2,4-d为因素设计2因素3水平的正交实验，共得到18个配方，每个处理至少15个外植体，每个配方重复3次。定期观察愈伤组织最早出现天数，愈伤组织诱导率、愈伤组织状态颜色等，筛选出最适合千里香诱导愈伤组织的材料、培养基配方。

表2千里香愈伤组织诱导正交实验设计

1、不同激素种类及浓度对千里香无菌苗叶片诱导愈伤组织的影响

无菌苗叶片剪切成合适的规格后，接种到愈伤组织诱导培养基，然后观察记录愈伤组织开始出现的时间、愈伤组织的诱导数目及状态等，愈伤组织诱导情况如图3所示，数据用spss20进行方差分析，其实验结果见表3。

表3不同激素组合对无菌苗叶片诱导愈伤组织的影响

由表3可以看出，愈伤组织诱导率最高的为ms+0.5mg/l2,4-d+0.5mg/l6-ba的配方(配方2)，其愈伤组织诱导率可高达86.53％，其次是ms+1.0mg/l2,4-d+1.0mg/l6-ba的配方(配方6)，其诱导率为84.44％，这两个配方生长素与细胞分裂素的比值均为1:1，且发现这2个配方中愈伤组织褐化率以2,4-d和6-ba浓度均为0.5mg/l时最低，而愈伤组织褐化对后一步的继代增殖及分化培养均有很大影响，因此ms+2,4-d0.5mg/l+6-ba0.5mg/l为最佳无菌苗叶片诱导愈伤组织配方。

另外，通过实验结果发现2,4-d为生长素的诱导配方其愈伤组织出现的时间相对于naa来说均较早，当生长素/细胞分裂素比值大于1时，其出现愈伤组织的天数为7～10天；而naa诱导的愈伤组织均在10天以后。

除此之外还发现2,4-d浓度过高，愈伤组织易出现褐化，而naa没有这种情况发生。

2、不同激素种类及浓度对千里香无菌苗根段愈伤组织诱的影响

无菌苗根段剪切成合适的规格后，接种到愈伤组织诱导培养基，然后观察记录愈伤组织开始出现的时间、愈伤组织的诱导数目及状态等，根段愈伤组织诱导情况如图4所示，数据用spss20进行方差分析，其实验结果见表4。

表4不同激素组合对千里香无菌苗根段愈伤组织诱导的影响

由表4可以看出，千里香无菌苗根段诱导愈伤组织结果为：根段愈伤组织诱导率最高的为ms+3mg/lnaa+0.5mg/l6-ba(配方17)，其诱导率可达100％，且未出现褐化；其次为ms+2mg/lnaa+0.5mg/l6-ba，其诱导率可达97.22％，且褐化率也较低，因此该配方也适合无菌苗根段愈伤组织的诱导。

3、初始诱导培养对愈伤组织继代增殖培养的影响

上一步骤的愈伤组织诱导对下一步骤的增殖会产生一定的影响，此部分实验愈伤组织增殖培养基采用统一的配方，即ms+0.5mg/l2,4-d+0.5mg/l6-ba，分别将两种不同来源(叶片、根段)的外植体经配方1～18诱导培养基诱导得到的愈伤组织接种到增殖培养基中，培养一个月后记录愈伤组织生长状况，如愈伤组织颜色、质地等。愈伤组织增殖情况如图5、图6所示，生长状况见表5。

表5不同来源外植体经不同诱导培养基诱导得到的愈伤组织增殖培养的情况

由表5可知，叶片愈伤组织继代到ms+2,4-d0.5mg/l+6-ba0.5mg/l的增殖培养基后，原来的诱导培养基中2,4-d浓度为2mg/l时，继代培养后仍然会褐化死亡(见图5中配方7、8、9)，其他配方诱导的叶片愈伤组织大多数为白绿色、质地坚实，因此前期的愈伤组织诱导中激素的作用对后期的继代增殖分化具有重要的影响。另外，发现愈伤组织诱导培养基配方为ms+2,4-d0.5mg/l+6-ba0.5mg/l(配方2)，继代后有愈伤组织分化出苗(见图5中配方2)，因此千里香无菌苗叶片的愈伤组织诱导与分化中，生长素与细胞分裂素的浓度越接近，其诱导效果越好。而无菌苗根段愈伤组织继代增殖培养中，愈伤组织生长状况良好，颜色黄白色、质地较好，且愈伤组织增殖明显，但未观察到分化现象，说明千里香无菌苗根段比叶片更适于进行愈伤组织的诱导。因此，配方2：ms+2,4-d0.5mg/l+6-ba0.5mg/l可以作为愈伤组织的诱导增殖分化培养基。

实施例3一种千里香愈伤组织的诱导方法

本实施例提供了一种千里香愈伤组织的诱导方法，包括以下具体步骤：

s1.材料的预处理：在超净工作台上，将千里香成熟种子先用75％乙醇溶液消毒1min，再用含有吐温20的0.1％hgcl2溶液消毒8min，吐温20：hgcl2溶液(v/v)＝1：1000，无菌水漂洗6遍，每次3min；经消毒后的种子放到灭菌的带盖组培瓶中备用，每次接种前将消毒好的种子放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干材料表面的水分，用镊子和手术刀去除种皮，然后接种到ms基本培养基中培养成无菌苗；

s2.愈伤组织的诱导：在超净工作台内将无菌苗取出，然后用剪刀将叶片及根剪下备用；无菌苗叶片在培养皿中剪成0.5cm×0.5cm的小片后接种到愈伤组织诱导培养基上培养至长出愈伤组织；所述诱导培养基是含有0.5mg/l2,4-d和0.5mg/l6-ba的ms基本培养基；

或千里香无菌苗的根在培养皿中剪去多余的须根后，再剪成约1cm的根段接种到愈伤组织诱导培养基中上培养至长出愈伤组织；所述诱导培养基是含有3.0mg/lnaa和0.5mg/l6-ba的ms基本培养基；

所述培养的条件为温度23～25℃，空气相对湿度50～70％，光强1500～2000lx。

本实施例所提供的诱导方法对于千里香种苗愈伤组织的诱导及多元化开发应用具有重要的现实意义，同时也可以为其他木本植物的相关研究提供一些参考。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。