本发明涉及植株培养技术领域，更具体的说是涉及一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法。
背景技术：
随着社会经济发的发展，橄榄油的营养、保健和医疗价值逐渐被人们认识和接受，橄榄油消费量急剧增长，巨大的市场空间和良好的经济效益促进油橄榄在多个省份开展种植，从而推动种苗需求的旺盛。目前油橄榄种苗繁殖常采用扦插繁殖方式，该方法繁殖速度快，成本较低，但是其受品种间遗传特性影响生根率存在差异；同时扦插苗无明显主根，根系生长较浅，且根系喜好中性偏碱的土壤，对于土质有较高要求，也在一定程度限制了油橄榄的种植。嫁接繁殖通过对砧木的选择可以提高土壤适应性，因此有必要开展特异性砧木培育研究，筛选合适砧木类型。实生砧木因根系有明显主根，常作为砧木培育的主要方向，其来源主要依靠实生种子获得，但由于油橄榄实生种子萌发后生长较为缓慢，存在休眠现象，且对果肉处理要求较高，处理不善，极易导致实生种子萌发失败，影响且限制了实生砧木的大规模培育。体细胞胚胎具有类似合子胚萌发机制，能自主生成根系，通过诱导体胚发生能在无限制条件下培养油橄榄砧木，且能保证基因型的一致性，为后期亲和性砧木培育提供技术支持。
因此，如何提供一种高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株的油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括如下步骤：
1)材料获取：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡，再将果核破开取出种仁；
2)灭菌：将所述步骤1)中取出的种仁清洗后吸干水分，进行酒精浸泡后再采用升汞浸泡，然后用清水冲洗后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；
3)将分离的胚和子叶分别置于油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养；
4)将所述步骤3)暗培养获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行暗培养；
5)待所述步骤4)中愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将其转移至光照培养室中进行光照培养，继续培养形成完整再生植株；
6)将再生植株驯化后移栽。
本发明的有益效果是：本发明中采用成熟的油橄榄种仁，在无菌条件下分离出子叶(多倍体)和胚(双倍体)进行体细胞胚胎发生，有效的解决了无法直接用油橄榄外植体体细胞胚胎发生和植株再生技术的难关，并且本发明体细胞胚胎发生及植株再生方法周期短、繁殖率高、成本低廉，还可以完整保留母本所有性状。
进一步，步骤1)中的干燥为：将果核放置在避免直射阳光照射、遮阴通风的位置放置28-31天。
进一步，步骤1)中的温水浸泡：在60-70℃的温水中浸泡22-25h。
进一步，步骤2)中的酒精浸泡为：采用70-80％的酒精浸泡20-30s。
进一步，步骤2)中的升汞浸泡为：采用0.08-0.1％的升汞浸泡8-10min。
采用上述进一步方案的有益效果是：将果核在60-70℃的温水中浸泡22-25h后，可以快速的去除果核、不伤果仁；而依次采用上述进一步方案中的酒精、升汞浸泡，可以在保证不损害种仁的情况下，有效的、彻底的对种仁表面进行杀菌消毒，使得种仁处于无菌状态。
进一步，步骤3)中油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基为：ms为基础培养基，ms基础培养基中添加2,4d1.5～3mg/l+6，ba0.2mg/l，蔗糖30g/l，ph5.8。
进一步，步骤3)中暗培养温度为22-25℃，诱导培养时间为25～35天。
进一步，步骤4)中体细胞胚胎发生培养基为：ms为基础培养基，ms基础培养基中添加kt0.2mg/l+6,ba0.1～0.5mg/l，iaa0.1～0.5mg/l+蔗糖35～50g/l，ph5.8。
进一步，步骤4)所述暗培养温度为25℃，培养时间为16-30天。
进一步，步骤5)中所述光照培养的培养基为：以wpm基本培养基，添加加蔗糖30g/l，ph5.8，光照强度5000lux；所述光照培养时间为60～90天。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，与现有技术相比，本发明的油橄榄体细胞胚胎固体培养植株再生方法，通过固体培养方式，形成稳定的油橄榄体细胞胚胎发生系统，从而更加高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株。建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的油橄榄固体培养基体细胞胚胎发生体系。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中在发明实施例中的2,4d为生长素或者生长素类似物；6,ba为6苄基腺嘌呤,细胞分裂素；kt为细胞分裂素；iaa为吲哚乙酸，wpm为本领域常规使用的wpm基本培养基：ms为本领域常规使用的ms基本培养基：
实施例1
油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：
1)材料获取：将收集的基因型为鄂植8号的油橄榄果实去除果肉，然后用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉。阴干后放置30天后，将果核放入60℃的温水中浸泡24h后去除，将果核破开，取出种仁；
2)灭菌：将取出的种仁用洗洁精清洗30min后，用清水冲洗2h后吸干水分，放入至75％酒精中20s后倒出，倒入0.1％的升汞浸泡10min，清水清洗3次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；
3)将分离的胚和子叶分别置于以ms+蔗糖30g/l为基本培养基，附加2,4d1.5mg/l+6,ba0.2mg/l+蔗糖30g/l组成油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基，ph5.8，在22℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导30天，获得愈伤组织；
4)将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以ms为基本培养基，附加kt0.2mg/l+6,ba0.5mg/l+iaa0.1mg/l+蔗糖35g/l的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养培养，诱导体细胞胚胎发生；
5)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以wpm基本培养基，附加蔗糖30g/l，ph5.8，在光照强度5000lux下培养时间为85天，获得再生植株。
6)将再生植株驯化后移栽到直径为6厘米的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:2)小盆中；随后进行正常的室外栽培。
实施例2
油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：
1)材料获取：将收集的基因型为城固32号的油橄榄果实去除果肉，然后用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉。阴干后放置28天后，将果核放入70℃的温水中浸泡20h后去除，将果核破开，取出种仁；
2)灭菌：将取出的种仁用洗洁精清洗30min后，用清水冲洗2h后吸干水分，放入至80％酒精中25s后倒出，倒入0.08％的升汞浸泡8min，清水清洗2次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；
3)将分离的胚和子叶分别置于以ms+蔗糖30g/l为基本培养基，附加2,4d2mg/l+6,ba0.2mg/l+蔗糖30g/l组成油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基，ph5.8，在24℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导35天，获得愈伤组织；
4)将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以ms为基本培养基，附加kt0.1mg/l+6,ba0.5mg/l+iaa0.4mg/l+蔗糖40g/l的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养油诱导体细胞胚胎发生；
5)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以wpm基本培养基，附加蔗糖30g/l，ph5.8，在光照强度5000lux下培养时间为60天，获得再生植株。
6)将再生植株驯化后移栽到直径为5厘米的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:2)小盆中；随后进行正常的室外栽培。
实施例3
油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括以下步骤：
1)材料获取：将收集的基因型为豆果(arbequnia)的油橄榄果实去除果肉，然后用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉。阴干后放置31天后，将果核放入65℃的温水中浸泡23h后去除，将果核破开，取出种仁；
2)灭菌：将取出的种仁用洗洁精清洗32min后，用清水冲洗2.5h后吸干水分，放入至70％酒精中30s后倒出，倒入0.1％的升汞浸泡10min，清水清洗3次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；
3)将分离的胚和子叶分别置于以ms+蔗糖30g/l为基本培养基，附加2,4d3mg/l+6,ba0.5mg/l+蔗糖30g/l组成油橄榄胚性愈伤组织诱导培养基进行ph5.8，在25℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导25天，获得愈伤组织；
4)将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以ms为基本培养基，附加kt0.2mg/l+6,ba0.5mg/l+iaa1.0mg/l+蔗糖50g/l的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养油诱导体细胞胚胎发生；
5)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以wpm基本培养基，附加蔗糖30g/l，ph5.8，在光照强度5000lux下培养时间为90天，获得再生植株。
6)将再生植株驯化后移栽到直径为8厘米的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:3)小盆中；随后进行正常的室外栽培。
生长状态观察
采用实施例1-3中的生长状态进行观察
主要观察指标：
实施例1中：3皿，15块愈伤组织，愈伤组织均呈淡黄色、致密状，生长速度适中且状态稳定；培养30天开始所有愈伤组织颗粒增大，内含物增多，逐渐变得饱满、紧实、光滑；到45天所有愈伤组织形成大量密集的球形胚，65天所有愈伤组织发育至鱼雷胚时期；85天时其中13块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟，90天时其余2块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟。
实施例2中：3皿，15块愈伤组织，愈伤组织均呈淡黄色、致密状，生长速度适中且状态稳定；培养35天开始所有愈伤组织颗粒增大，内含物增多，逐渐变得饱满、紧实、光滑；诱导培养到45天时所有愈伤组织形成大量密集的球形胚，65天时12块愈伤组织发育至鱼雷胚时期，其中3块愈伤组织的体细胞胚胎发育成子叶胚；88天时所有愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟。
实施例3中：3皿，15块愈伤组织，愈伤组织均呈淡黄色、致密状，生长速度适中且状态稳定；培养25天开始所有愈伤组织颗粒增大，内含物增多，逐渐变得饱满、紧实、光滑；到45天时所有愈伤组织形成大量密集的球形胚，65天时14块愈伤组织发育至鱼雷胚时期，其中1块愈伤组织的体细胞胚胎发育成子叶胚；87天时14块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟，90天时其余1块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟。
由上述结果得出以下结论：本发明油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法，愈伤组织生长速度基本一致，且生长速度较快，可以高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株，建立出稳固、高频、操作简单的油橄榄固体培养基体细胞胚胎发生体系。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。