一种东方栓菌的快速人工栽培方法与流程

本发明涉及食用菌栽培及其应用领域，具体涉及一种东方栓菌的快速人工栽培方法。
背景技术：
：东方栓菌（trametesorientalis），阔叶树白腐真菌，属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，栓菌属。成熟子实体无柄，菌盖半圆形扁平，新鲜时柔韧，老熟后变坚硬，有瘤状突起，少见环带，米黄色或淡青灰色，至浅棕灰色或烟灰色，有深色环纹，表面常有菌盖同色小疣，初期有绒毛，渐变光滑，2～13cm×4～26cm，厚3～10mm，边缘钝。菌肉木栓质，污白色至淡青灰色，厚3～6mm。菌管与菌肉同色，长3～13mm；管口白色，圆形或近多角形，平均每毫米3个，壁厚薄不定，孢子无色，光滑，长椭圆型，有尖，5～8μm×2~3μm。菌丝厚壁，少分枝，子实体内菌丝少见横隔以及锁状联合，基质内菌丝有横隔及锁状联合，粗2.5～5.5μm。东方栓菌具有良好的药用价值，可用于肺结核以及支气管炎等呼吸道炎症，普通外伤消炎，以及风湿类病症。尤其值得注意的是，早在1973年日本的伊藤ひろと等人即发现，东方栓菌的子实体中的多糖提取物，对小白鼠肉瘤以及艾氏腹水瘤的抑制率为80%~100%。近年来yizheng等人又发现，东方栓菌的水溶性多糖具有免疫调节活性，也是一种具有相当潜力的新型抗癌药物。东方栓菌是我国北方一个少数民族治疗子宫肿瘤的药材。《中国抗肿瘤大型药用真菌图鉴》介绍了东方栓菌的抗肿瘤作用。东方栓菌的子实体的来源往往需要野外采集获得。东方栓菌野生是一年生，长在森林中阔叶树的枯枝上，在全国都有分布，但是量不大。目前尚没有人工栽培的先例。本发明主要提供了一种东方栓菌快速人工栽培方法。所用东方栓菌菌种（编号tajlg20180120）是经野生子实体分离纯化而得，该菌种抗杂能力很强。本发明专利的栽培方法简便，生产效率高，适于大规模推广应用。技术实现要素：一种东方栓菌的快速人工栽培方法，包括菌种分离、母种扩大培养、原种制备、栽培种制备、发菌、出菇诱导、子实体采收等步骤，详述如下：菌种分离，选取形状正常的野生的新鲜东方栓菌子实体，清理去表面以及基部的杂物后，以70%乙醇消毒表面以后，以无菌解剖刀切开，选区菌肉与菌管交界处的菌丝小块，放置于改良pda培养基平板表面，置于25°c恒温培养箱中避光培养5d至菌丝出现，挑取菌丝接种于改良pda培养基斜面上，置于25°c恒温培养箱中避光培养5d至菌丝形成菌落，对菌落进行显微观察并与野生子实体进行dna比对后，将确认为东方栓菌菌丝的斜面进行无菌检查后移至4°c冰箱中避光保藏，编号tajlg20180120。母种扩大培养，使用改良pda培养基（comprehensivepotatoesmedium，spda）平板，具体配方为土豆200g（浸汁），蔗糖20g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o1.5g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，vb10.05mg，琼脂16g，蒸馏水1000ml。5%naoh以及5%hcl调节ph至6.4，121°c高压蒸汽灭菌30min。取4°c冰箱中保藏东方栓菌试管母种，置于25°c恒温培养箱中活化48h后，分别以接种铲铲取0.5mm2见方小块，接种于改良pda培养基斜面表面后，置于25°c恒温培养箱中避光培养10d至菌丝长满斜面。液体种子扩大培养，使用改良pda液体培养基。具体配方为土豆200g（浸汁），蔗糖20g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o1.5g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，vb10.05mg，蒸馏水1000ml，5%naoh以及5%hcl调节ph至6.4。配好定容后，分装250ml三角瓶，每瓶90ml，8层纱布封口后，121°c高压蒸汽灭菌30min。取已扩大的东方栓菌试管母种，以接种铲铲取0.5mm2见方小块，接种于改良pda液体培养基，每瓶3小块，置于25°c恒温旋转摇床，160r∙min-1中避光培养7d至菌丝成细碎菌丝球为止。固体原种制备，使用小麦粒固体培养基。具体配方为裸麦97%（预先以5%石灰水泡胀隔夜，以清水冲洗至无石灰粉沫为止，沥干），石膏2%，蔗糖1%。分装500ml聚乙烯塑料瓶（自带透气封口盖），每瓶450g，封口后，121°c高压蒸汽灭菌90min。待菌种瓶彻底冷却后，以无菌甘油注射器吸取制备好的液体种子30ml，注入菌种瓶麦粒表面。菌种瓶瓶口向上，置于培养室中，维持温度15~25°c，相对湿度60~80%rh，避光培养3~5周视气温而定）至菌丝发满为止。栽培种制备与发菌，使用棉籽壳麸皮固体培养基。具体配方为：①棉籽壳80%，麸皮16%，石膏2%，石灰1%，蔗糖1%，含水量75%；②阔叶树木屑77%，麸皮20%，石膏1%，石灰1%，蔗糖1%，含水量75%；按上述配方配制好后，分装18×35cm聚丙烯折角袋，每袋1000g，套环封口后，121°c高压蒸汽灭菌100min。菌袋彻底冷却后，以镊子掰取3×3cm制备好的固体原种一块，埋入菌袋木屑表面。菌袋横卧，置于培养室培养架上（每层菌袋不得超过4叠），维持温度15~25°c，相对湿度60~80%rh，避光培养3~5周（视气温而定）至菌丝发满为止。出菇诱导，菌丝发满后的栽培种，置于25~30°c，相对湿度80~90%rh，散射光400~800lux的环境中，使用锋利的刀片，将菌袋沿长轴纵划5~6cm小口，间隔5cm，每侧一组，见示意图1。划好小口的菌袋分开摆放，左右间隔15cm，上下间隔视培养架上下层间隔而定不做要求，菌棒长轴朝向与本地夏季盛行风向垂直，摆放好后2~4d（视气温而定），可见气生菌丝钻出菌袋上的出菇小口，此时应使用雾状水喷淋菌袋表面催菇。待10~15d（视气温而定）白色瘤状原出现于菌袋出菇小口（划痕）后，每天喷雾状水与培养室空中与地面，早晚各一次，不可再向菌袋喷水。子实体采收，经过10~20d（视气温而定）待子实体长大至直径6~8cm大小，尚未开始大规模弹射担孢子时，即要进行采收。使用锋利的刀片或竹刀沿菌袋长轴将子实体贴袋壁割下，即完成采收。采收后应用小刀剔除菌袋出菇口附近残存原基与老化菌皮，重新回归上述出菇诱导。子实体可采收2~4次。栽培种可使用棉籽壳代替阔叶树木屑（壳斗科为佳）以及经过堆积陈化的针叶树木屑，其他配方不变。其中使用棉籽壳与阔叶树木屑者产量相当，使用陈化针叶树木屑者产量较低且出菇较迟。本发明的特点，第一使用了经由组织分离得到的东方栓菌菌种，纯培养的菌种能够排除杂菌污染并有极高的遗传稳定性，提高了大规模栽培的稳定性和重复性。第二，斜面扩大以及使用液体摇瓶发酵对东方栓菌进行扩繁，通过固体培养基进行再增菌，三级制种模式能够对东方栓菌进行快速放大，能较容易的提高生产规模并缩短生产周期，并对种质的稳定性贡献良多。第三，使用棉籽壳代替木屑作为栽培种原料，使得东方栓菌的栽培脱离了野生木质基质，扩大了生产用的原料来源，减少了对林业资源的依赖，也降低了大规模生产的相对成本。第四，通过营养丰富的代料栽培，提高了东方栓菌生长过程中的营养水平，使得子实体产量相对于野生条件下在质量与数量上都有提高。第五，采用了催菇措施，使得东方栓菌子实体的发生与生长在时间与空间上准确可控，降低了子实体诱导发生的难度，降低了大规模生产种环境控制的成本，同时也使得合理安排生产周期节约人工成为可能。本发明的有益效果是实现了东方栓菌的人工栽培，3~6个月即可获得子实体。东方栓菌具有良好的药用价值，可用于肺部感染（如肺结核）；呼吸道感染（支气管炎等呼吸道炎症）普通外伤（消炎），以及风湿类病症。因此本发明，开拓了东方栓菌的子实体来源，为此后对东方栓菌的开发与相关药理，生理学研究打下了基础，并能稳定提供了工业化生产的原料。附图说明图1.出菇菌袋出菇小口示意图。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步说明：实施实例一：此种东方栓菌的栽培方法，包括以下操作步骤：母种扩大培养，使用改良pda培养基（comprehensivepotatoesmedium，spda）平板，具体配方为土豆200g（浸汁），蔗糖20g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o1.5g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，vb10.05mg，琼脂16g，蒸馏水1000ml。5%naoh以及5%hcl调节ph至6.4，121°c高压蒸汽灭菌30min。取4°c冰箱中保藏东方栓菌试管母种，置于25°c恒温培养箱中活化48h后，以接种铲铲取0.5mm2小片段培养基接种于改良pda培养基斜面表面后，置于25°c恒温培养箱中避光培养10d至菌丝长满斜面。液体种子扩大培养，使用改良pda液体培养基。具体配方为土豆200g（浸汁），蔗糖20g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o1.5g，mnso40.05g，feso4·7h2o0.05g，vb10.05mg，蒸馏水1000ml，5%naoh以及5%hcl调节ph至6.4。配好定容后，分装250ml三角瓶，每瓶90ml，8层纱布封口后，121°c高压蒸汽灭菌30min。取已扩大的东方栓菌试管母种，接种于改良pda液体培养基，每瓶3小块，置于25°c恒温旋转摇床，160r∙min-1中避光培养5d至菌丝成细碎菌丝球为止。固体原种制备，使用小麦粒固体培养基。具体配方为1）裸麦97%（预先以5%石灰水泡胀隔夜，以清水冲洗至无石灰粉沫为止，沥干），石膏2%，蔗糖1%。分装500ml聚乙烯塑料瓶（自带透气封口盖），每瓶450g，封口后，121°c高压蒸汽灭菌90min。待菌种瓶彻底冷却后，以无菌甘油注射器吸取制备好的液体种子30ml，注入菌种瓶麦粒表面。菌种瓶瓶口向上，置于培养室中，维持温度25°c，相对湿度60~80%rh，避光培养21d至菌丝发满为止。栽培种制备与发菌，使用棉籽壳麸皮固体培养基。具体配方为1）棉籽壳80%，麸皮16%，石膏2%，石灰1%，蔗糖1%，含水量75%；2）阔叶树木屑77%，麸皮20%，石膏1%，石灰1%，蔗糖1%，含水量75%。按上述配方配制好后，分装18×35cm聚丙烯折角袋，每袋1000g，套环封口后，121°c高压蒸汽灭菌100min。菌袋彻底冷却后，以镊子掰取3×3cm制备好的固体原种一块，埋入菌袋培养料表面。菌袋横卧，置于培养室培养架上（每层菌袋不得超过4叠），维持温度25°c，相对湿度70~80%rh，避光培养21d至菌丝发满。出菇诱导，菌丝发满后栽培种置于25°c，相对湿度90%rh，雾状水喷雾保湿，散射光800lux的环境中，使用锋利的刀片，将菌袋沿长轴纵划5~6cm小口，间隔5cm，每侧一组，划好小口的菌袋分开摆放，左右间隔15cm，摆放后2d，气生菌丝钻出菌袋上的出菇小口，使用雾状水喷淋菌袋表面催菇，每日一次。待10d后即可见白色瘤状原基出现于菌袋出菇小口，停止喷水催菇，每天喷雾状水与培养室空中与地面，早晚各一次。子实体采收，再经10d待子实体长大至直径6~8cm大小，尚未开始大规模弹射担孢子时，即要进行采收。使用锋利的刀片或竹刀沿菌袋长轴将子实体贴袋壁割下，即完成采收。采收后应用小刀剔除菌袋出菇口附近残存原基与老化菌皮，重新回归上述出菇诱导。再经12d出菇诱导，以及15d子实体成长后进行第二次采收。整个栽培过程耗时106d，共采收两潮子实体，生物学效率75%（干重）。栽培种可使用阔叶树木屑（壳斗科为佳）以及经过堆积陈化的针叶树木屑代替棉籽壳，其他配方不变。其中使用阔叶树木屑者产量与棉籽壳相当，使用陈化针叶树木屑者产量较低且出菇较迟。实施实例二：此种东方栓菌的栽培方法，包括以下操作步骤：母种扩大培养，使用改良pda培养基，取4°c冰箱中保藏东方栓菌试管母种，置于25°c恒温培养箱中活化48h后，分别以接种铲铲取0.5mm2见方小块，接种于改良pda培养基斜面表面后，置于25°c恒温培养箱中避光培养10d至菌丝长满斜面。液体种子扩大培养，使用改良pda液体培养基，分装250ml三角瓶，每瓶90ml，8层纱布封口后，121°c高压蒸汽灭菌30min。取已扩大的东方栓菌试管母种，以接种铲铲取0.5mm2见方小块，接种于改良pda液体培养基，每瓶3小块，置于25°c恒温旋转摇床，160r∙min-1中避光培养7d至菌丝成细碎菌丝球为止。固体原种制备，使用小麦粒固体培养基。具体配方为裸麦97%，石膏2%，蔗糖1%。分装500ml聚乙烯塑料瓶（自带透气封口盖），每瓶450g，封口后，121°c高压蒸汽灭菌90min。待菌种瓶彻底冷却后，以无菌甘油注射器吸取制备好的液体种子30ml，注入菌种瓶麦粒表面。菌种瓶瓶口向上，置于培养室中，维持温度20°c，相对湿度60%rh，避光培养25d至菌丝发满为止。栽培种制备与发菌，使用2）木屑麸皮固体培养基。具体配方为阔叶树木屑77%，麸皮20%，石膏1%，石灰1%，蔗糖1%，含水量75%。按上述配方配制好后，分装18×35cm聚丙烯折角袋，每袋1000g，套环封口后，121°c高压蒸汽灭菌100min。菌袋彻底冷却后，以镊子掰取3×3cm制备好的固体原种一块，埋入菌袋木屑表面。菌袋横卧，置于培养室培养架上，维持温度20°c，相对湿度80%rh，避光培养30d至菌丝发满为止。出菇诱导，菌丝发满后的栽培种，置于20°c，相对湿度90%rh，散射光400lux的环境中，使用锋利的刀片，将菌袋沿长轴纵划5~6cm小口，间隔5cm，每侧一组，划好小口的菌袋分开摆放，左右间隔15cm，菌棒长轴朝向与本地夏季盛行风向垂直，摆放好后5d，气生菌丝钻出小口后使用雾状水喷淋菌袋表面催菇。10d后白色瘤状原出现于菌袋出菇小口后，每晚喷雾状水与培养室空中与地面。子实体采收，经过20d待子实体长大至直径6~8cm大小，用锋利的刀片或竹刀沿菌袋长轴将子实体贴袋壁割下，即完成采收。采收后应用小刀剔除菌袋出菇口附近残存原基与老化菌皮，重新对菌袋喷水进行催菇，生物学效率78%，共耗时d。第二潮菇催菇耗时10d，子实体生长20d，生物学效率35%，第三潮菇催菇耗时12d，子实体生长20d，生物学效率20%。栽培种可使用阔叶树木屑（壳斗科为佳）以及经过堆积陈化的针叶树木屑代替棉籽壳，其他配方不变。其中使用阔叶树木屑者产量与棉籽壳相当，使用陈化针叶树木屑者产量较低且出菇较迟。两次栽培的子实体出菇结果如下第一潮第二潮第三潮总生物学效率实例一79d27d0d75%实例二102d30d32d133%由上表可见，本发明实施例栽培东方栓菌，在人工代料栽培的条件下可以实现东方栓菌的人工栽培，栽培过程原料来源广泛，控制容易且有相当高的生物学效率。当前第1页12