一、
技术领域：
：本发明涉及一种提高蚂蟥越冬产量和品质的方法，属于药用动物养殖领域。二、
背景技术：
：：蚂蟥(whitmaniapigrawhitman)，又名宽体金线蛭。中国动物志(1996)记载为黄蛭科(haemopidae)动物，中国药典(2015)记载为水蛭科(hirudinidae)动物，其干燥全体为中药材水蛭，具有破血通经，逐淤散结的功效。近年来对蚂蟥生物学特性、消化生理、呼吸生理、养殖密度等方面进行了大量研究，蚂蟥人工养殖初步取得成功。但随着相关中成药的开发，其需求量快速增长，野生资源日渐枯竭。研究发现蚂蟥具有冬眠习性，自然条件下，当环境温度低于10℃时，蚂蟥停止进食，环境温度低于4℃时，蚂蟥进入冬眠，出冬眠后体重减少、死亡率升高，抗凝血酶活性下降，如何减少蚂蟥越冬后的损失成为生产上亟待解决的热点问题。甲基睾酮(mt)是一种重要的雄性激素，在多个组织系统中都能发挥出生理作用。一般补充雄激素后，会引起血浆中睾酮(t)含量增高，使得血液与睾丸之间的t浓度梯度降低，导致生精小管中雄激素增加，从而有利于精子发生。并且外源mt还能促进动物的生长发育。近年来mt被广泛应用在水产养殖上，但鲜见用于蚂蟥养殖上的研究报道。三、技术实现要素：本发明目的是在现有蚂蟥养殖基础上，提供一种显著促进越冬蚂蟥生长，增加经济效益的养殖方法。本发明在蚂蟥养殖水体中添加mt，使养殖水体中mt浓度为10～100μg.l-1。养殖过程中3天换1次水同时清除残留物，换水时间固定。换水后投喂清洗后的新鲜螺蛳(梨形环棱螺)，养殖过程中及时清理死亡蚂蟥。通过实验统计和比较发现，与不添加mt相比，采用本发明使蚂蟥越冬后存活率提高4.43％，产量最高增加约37.43％，同时抗凝血酶含量提高2.62％。本发明在不扩大蚂蟥养殖面积的前提下，增加了蚂蟥养殖的经济效益。与现有蚂蟥养殖技术相比，应用本发明越冬前短期添加6周mt后自然冬眠60天，每亩最高可增加蚂蟥干重约15.0公斤(以每亩产量50kg计)，按目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约1.5万元。四、具体实施方式1.材料1.1实验材料及仪器：蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥w.pigra。agilent1200-6410b三重串联四级杆液质联用仪(安捷伦科技有限公司)、eclipseplusc18色谱柱(2.1×150mm，3.5μm)、水浴氮吹仪(上海允延仪器有限公司)、lc-c18固相萃取柱(沃特世科技有限公司)、rm2015切片机(leica公司)、dfc450c正置荧光显微镜(leica公司)等。2方法2.1试验设计11月份取5.5月龄健康蚂蟥，体重4.5g±0.5g。试验设置养殖水体mt浓度为0.1ug.l-1、1.0ug.l-1、10.0ug.l-1、100.0ug.l-1、150.0ug.l-1，5个实验处理组和1个空白对照组，分别标记为mt1、mt2、mt3、mt4、mt5、ck，每组24瓶，每瓶10条蚂蟥。其它养殖管理条件相同，实验处理6周后，蚂蟥自然越冬至来年3月份检测生长、性腺发育情况。2.2体重、特定生长率、存活率的测定实验处理后，通过分析天平精确称量蚂蟥体重、性腺重量，存活率(sr)、性腺指数(gsi)、增重率(wgr)、特定生长率(sgr)根据以下公式进行计算。公式中w1为实验初始体重(g)，w2为实验末体重(g)。t为总时间天数(d)wgr＝(w2-w1)/w1×100％sgr＝(lnw2-lnw1)/t×100％sr＝(总条数-死亡数)/总条数×100％2.3蚂蟥内源类固醇激素测定液氮下磨碎蚂蟥组织样品5.0g(精确至0.01g)，加入叔丁基甲醚15ml，10％na2co3溶液3ml，旋涡混匀器混匀提取1min，室温超声提取30min。10000r·min-1离心5min，取上清液，下层重复提取3次，合并有机相，40℃氮气吹干。加20％甲醇溶液5ml溶解残渣，旋涡混匀1min，4℃冰箱中放置1h后，10000r·min-1离心5min，取上清液，获得激素粗提液。lc-c18固相萃取柱先经5ml甲醇和5ml水活化。上清液过柱后，用5ml20％甲醇溶液淋洗，真空抽干3min，用5ml甲醇洗脱，收集甲醇相，氮吹至干。残余物用v(乙腈)∶v(水)＝1∶1定容至0.5ml，漩涡混匀30s，过0.22μm微孔滤膜，进行hplc-ms/ms分析。2.4蚂蟥药材内在品质测定测定蚂蟥水分、灰分、酸不溶灰分、酸碱度以及抗凝血酶活性，测定方法参照《中国药典》(2015版)。2.5数据分析使用spss17.0软件进行数据统计分析，单因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05表示差异显著。3结果与分析3.1mt对越冬蚂蟥生长的影响不同浓度mt对蚂蟥生长的影响见表1。由表1可知，外源mt组最终体重、特定生长率以及存活率均高于ck组，随着外源mt浓度升高呈先上升后下降趋势，其中mt4组显著高于其他组(p＜0.05)；除mt5组外，mt其余4组存活率均高于ck组，其中mt3组显著高于ck组(p＜0.05)。表1外源mt对蚂蟥生长的影响table.1theeffectofmtongrowthtargetofwhitmaniapigra注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，下表同。3.2mt对越冬蚂蟥内源类固醇激素的影响mt对蚂蟥体内性类固醇激素的影响见表2。由表2可知，随外源mt浓度升高，mt组性类固醇激素呈升高后降低趋势，mt4组内源雄激素显著高于其它组别(p＜0.05)，其中甲基睾酮浓度均高于同组睾酮浓度；mt3组内源雌激素显著高于其他组(p＜0.05)，其中雌酮(e1)浓度均高于同组雌三醇(e3)浓度；mt4组内源黄体酮最高，其中mt5组显著低于其他组(p＜0.05)。表2外源mt对蚂蟥内源类固醇激素水平的影响table.2theeffectmtonendogenoussteroidhormonelevelsofwhitmaniapigra3.3mt对越冬蚂蟥内在品质的影响不同浓度mt对蚂蟥内在品质的影响见表3。由表3可知，各组水分、酸不溶性灰分、酸碱度和抗凝血酶活性等检查指标均符合《中国药典》(2015年版)药材水蛭标准。mt组抗凝血酶活性均高于ck组，其中mt2组显著高于除mt5组外的其它组别(p＜0.05)。表3外源mt对蚂蟥药材品质的影响table.3theeffectofmtonthrombinlevelsofwhitmaniapigra3.4综合评判本实验结果显示，添加浓度为10～100ug.l-1mt均能促进蚂蟥生长，其中添加100ug.l-1mt的蚂蟥生长性能最好，体重增加最多，存活率也较高。与不添加mt相比，采用本发明使蚂蟥越冬后存活率最高可提高4.43％，产量最高增加约37.43％，同时抗凝血酶含量提高2.62％。与现有养殖技术相比，应用本发明越冬前短期添加6周mt后自然冬眠60天，在提高越冬存活率和蚂蟥内在品质的同时，每亩最高可增加蚂蟥干重约15.0公斤(以每亩产量50kg计)，按目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约1.5万元。具体实施例1：选取体重为4.5±0.5g的蚂蟥放置在容积为2l的塑料瓶中添加6周后自然冬眠60天，每瓶5条。实施地点在南京农业大学中药材研究所。添加激素为mt，使养殖水体中mt浓度为100ug.l-1。3天换1次水，使用曝气24h的自来水，换水时间为下午3：00左右，每次换水100％并清除残留螺蛳。换水后投喂清洗后在自来水中暂养3天的新鲜梨形环棱螺。养殖过程中发现有死亡蚂蟥及时清理。收获时蚂蟥干品折合亩产约达155.4千克。本发明阐述的实施例及权利要求并不是对本发明的限定，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化均落入本发明保护范围内。当前第1页12当前第1页12