一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法与流程

本发明属于稚鱼肌间骨染色技术领域，具体涉及一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，该方法在黄河鲤肌间骨骨化过程，及分子机制研究中具有重要用途，适用于染色后获得透明标本，可用体视镜清晰地观察到稚鱼肌间骨的附着位置。

背景技术：

黄河鲤（cyprinuscarpio）隶属鲤形目（cypriniformes），鲤科（cyprinidae），鲤属（cyprinus）。黄河鲤是我国黄河长期自然形成的特有的重要淡水经济鱼类，具有适应性强、食性广、抗逆性强、外表美观、味道鲜美等优点。但由于肌间骨的存在，给黄河鲤的食用带来极大的不便，也限制了黄河鲤的养殖业的发展。黄河鲤稚鱼染色不仅促进了解肌间骨分布与骨化，还能为其肌间骨分子机制的研究和培育少肌间骨鱼类奠定基础。

鱼类的肌间骨又称为肌间刺，是由肌间的间充质细胞不经过软骨阶段直接发育而来。依据肌间骨附着部位可将其分为三类：附着在髓弓上的髓弓小骨，附着在脉弓上的脉弓小骨以及附着在椎体上的椎体小骨。

目前已经有团头鲂和黄鳝成鱼的染色技术，但是还没有针对黄河鲤稚鱼肌间骨染色方法。团头鲂成鱼体长一般在165-456mm之间，黄河鲤稚鱼的体长在9-15mm之间，体重在6-10mg之间，团头鲂成鱼骨骼鳞片和器官都已发育完全，黄河鲤稚鱼骨骼鳞片都处在发育过程中。稚鱼肌间骨较之成鱼纤细、钙化程度低，茜素红难以与肌间骨上的钙结合，肌间骨不易着色；稚鱼肌肉易着色，在肌肉褪色过程中，肌间骨也易随之褪色。故，在固定标本，去除体表鳞片和色素，肌间骨与茜素红染液的结合强度，去除内脏，肌肉透明和观察肌间骨等方面，成鱼肌间骨与稚鱼肌间骨染色都有较大区别。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种方法简单、易于操作且所用试剂廉价易于购买的黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，该方法易于获得身体透明，可用体视镜清晰观察到肌间骨位置的黄河鲤稚鱼标本，在黄河鲤稚鱼肌间骨骨化及其它鲤科鱼类稚鱼肌间骨骨化研究中具有重要意义。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体过程为：

（1）对出膜后22-26天的小鱼进行取材，并用3wt%-5wt%的pfa固定24小时；

（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；

（3）再转移鱼体到tbst溶液中漂洗20-30分钟；

（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的tbst；

（5）转移鱼体到1wt%koh溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；

（6）转移鱼体到新的1wt%koh溶液中，再加入茜素红染液进行染色，koh溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，于19-31℃进行染色，染色时间8-12小时；

（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；

（8）用1wt%koh溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为1%-5%，在强光下照射，至鱼体表面出现大量气泡为止，脱去鱼体表面色素，此过程5-20分钟；

（9）倒掉溶液，加入1wt%koh溶液，洗去残余的双氧水；

（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明0-30分钟；

（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；

（12）在100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。

进一步优选，所述黄河鲤稚鱼肌间骨染色的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）对出膜后24天的小鱼进行取材，并用4wt%pfa固定24小时；

（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；

（3）再转移鱼体到tbst溶液中漂洗30分钟；

（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的tbst；

（5）转移鱼体到1wt%koh溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大程度适当延长时间，直至头部透明；

（6）转移鱼体到新的1wt%koh溶液中，再加入茜素红染液进行染色，koh溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，25℃常温染色，染色时间10小时；

（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗1-2次，直至蒸馏水没有明显颜色；

（8）用1wt%koh溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为3%，在强光下照射，至鱼体表明出现大量气泡为止，褪去鱼体表面色素，此过程10分钟；

（9）倒掉溶液，加入1wt%koh溶液，洗去残余的双氧水；

（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度透明，透明30分钟，可根据颜色深浅在体积分数50%的甘油水溶液中延长透明时间；

（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；

（12）在体积分数100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。

本发明具有以下优点和有益效果：本发明使用最佳的试剂，通过对不同染色条件的探索，筛选出最优的染色条件，最终获得身体透明、肌间骨染色为红色或紫色的黄河鲤稚鱼优质标本，可用体式镜清楚的观察到肌间骨附着位置，不仅为稚鱼肌间骨形态学研究提供方便，也可用于科普及作为艺术品。

附图说明

图1是黄河鲤稚鱼肌间骨染色整体示意图；

图2是黄河鲤稚鱼尾部肌间骨示意图，可以清楚地看到髓弓小骨和脉弓小骨；

图3是黄河鲤稚鱼尾部脉弓小骨的示意图；

图4为黄河鲤稚鱼头部髓弓小骨的示意图；

图5-7是未用双氧水褪色的示意图；

图8-10是染色6小时示意图，稚鱼肌间骨明显未着色；

图11-12是染色8小时示意图，稚鱼肌间骨染色不清晰且头部未着色；

图13-16分别是19℃、25℃、31℃和37℃染色效果图；

图17-20分别是1wt%、3wt%、5wt%和7wt%的双氧水不同褪色时间图；

图21是甘油不同透明时间图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明具体实施过程中的技术方案进行清楚、完整、具体的描述。

实施例1

肌间骨染色原理是茜素红的羟基蒽醌结构和钙离子发生螯合反应，产生一种带色化合物，这样成骨细胞诱导的外层的钙结节就染成了深红色。对于一种化学反应，除反应物和底物以外，对其影响最大的便是反应温度和反应时间。因此本实施例分别对温度和染色时间对黄河鲤稚鱼肌间骨染色效果的影响进行了分析评估，并选择了最佳的染色温度和染色时间。

通过对6、8、10小时不同染色时间和19℃、25℃、31℃、37℃不同染色温度的效果图进行分析，探索出能够获得最佳染色品质的方法。

6小时、8小时、10小时不同染色时间，染色效果对比：

（1）取材固定，对稚鱼取材，并用4wt%pfa固定24小时，其中pfa是将3-5g的多聚甲醛溶于pbs中，ph调至7.2；

（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；

（3）再转移鱼体到tbst溶液中漂洗30分钟；

（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的tbst；

（5）转移鱼体到1wt%koh溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大适当延长时间，直至头部透明；

（6）转移鱼体到新的1wt%koh溶液中，再加入茜素红染液进行染色，koh溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，25℃常温染色，染色时间分别是6小时、8小时、10小时；

（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗2次；

（8）用1wt%koh溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度3%，在强光下照射，至鱼体表明出现气泡为止，脱去鱼体表面色素，此过程15分钟，根据鱼体大小可适当延长；

（9）倒掉溶液，加入1wt%koh溶液，洗去残余的双氧水；

（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度稀释；

（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；

（12）在体积分数100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。

染色6小时染色结果请参见图8-10。

染色8小时染色结果请参见图11-12。

染色10小时染色结果请参见图1-3。

通过对不同染色时间的比较发现，染色10小时的效果更好（肌间骨着色并更清晰）。

19℃、25℃、31℃、37℃不同染色温度，染色效果对比：

（1）取材固定，对稚鱼取材，并用4wt%pfa固定24小时；

（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；

（3）再转移鱼体到tbst溶液中漂洗30分钟；

（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的tbst；

（5）转移鱼体到1wt%koh溶液，浸泡30分钟，根据鱼体过大可适当的延长时间，直至头部透明；

（6）转移鱼体到新的1wt%koh溶液中，再加入茜素红染液进行染色，koh溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，染色时间10小时，并设置不同的温度梯度19℃、25℃、31℃、37℃进行染色；

（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗2次；

（8）用1wt%koh溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度3%，在强光下照射，至鱼体表面出现大量气泡为止，褪去鱼体表面色素，此过程15分钟，根据鱼体大小可适当延长；

（9）倒掉溶液，加入1wt%koh溶液，洗去残余的双氧水；

（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度稀释；

（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；

（12）在体积分数100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。

染色效果图参见图13-16。

头部肉和脂质较厚，肌间骨较之尾部难着色，通过对头部肌间骨染色情况的比较发现25℃较之19℃、31℃和37℃染色效果更好。

实施例2

鱼体表面色素对稚鱼肌间骨的观察产生阻碍，双氧水可去除鱼体表面色素，便于观察染色的肌间骨。本实施例通过褪色时间探索出最佳的双氧水浓度。

对双氧水浓度和脱色时间的优化，利用1wt%、3wt%、5wt%、7wt%等不同浓度的双氧水，观察褪色时间及褪色效果，选择最优的褪色浓度：

（1）取材固定，对稚鱼取材，并用4wt%pfa固定24小时；

（2）染色前先用蒸馏水漂洗鱼体，每次10分钟，漂洗三次，去除固定液；

（3）再转移鱼体到tbst溶液中漂洗30分钟；

（4）然后用蒸馏水漂洗10分钟，去除残余的tbst；

（5）转移鱼体到1wt%koh溶液，浸泡30分钟；

（6）转移鱼体到新的1wt%koh溶液中，再加入茜素红染液进行染色，koh溶液与茜素红染液的体积比例为3:1，染色10小时；

（7）倒掉染色液，加入蒸馏水，洗去多余的染色液，重复洗2次；

（8）用1wt%koh溶液稀释双氧水，将双氧水稀释成体积浓度为1%、3%、5%和7%，在强光下照射，至鱼体表明出现气泡为止，脱去鱼体表面色素，观察各浓度脱色时间和脱色效果；

（9）倒掉溶液，加入1wt%koh溶液，洗去残余的双氧水；

（10）将黄河鲤稚鱼放置体积分数20%、50%的甘油水溶液中梯度稀释；

（11）用体式镜观察染色结果并拍照留存；

（12）在体积分数100%甘油中保存黄河鲤稚鱼。

染色结果请参见图17-20。

虽然体积浓度5%较之3%和1%的双氧水可以在更短时间内褪去鱼体表面色素，但是鉴于体积浓度7%严重腐蚀鱼体表面和考虑到体积浓度5%对肌间骨的影响，所以我们选择温和且效果相对较好的体积浓度3%作为双氧水的褪色浓度。

通过用体积分数20%甘油水溶液透明0分钟、10分钟、30分钟、50分钟观察发现，透明0-30分钟效果较好，但可根据鱼体着色的深浅适当的延长在体积分数50%甘油水溶液中的透明时间，具体图请参见图21。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。