一种高效的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型及其构建方法与流程

本发明涉及动物模型构建
技术领域：
，更具体地，涉及一种高效的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型及其构建方法。
背景技术：
：随着我国经济的不断发展，人们生活水平不断提高，心血管疾病包括高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化等疾病的发病率在我国已呈逐年上升趋势。其中高脂血症是机体脂代谢紊乱的重要标志，也是动脉粥样硬化、心脏病、脑血管意外和脂肪肝的主要危害因素之一，主要表现为血清中甘油三酯(triglyceride，tg)、总胆固醇(totalcholesterol，tc)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，ldl)含量增高和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，hdl)含量降低。目前寻找安全高效的降血脂药物已成为广大医药卫生工作者研究的热点之一，而实验动物模型是进行上述研究的必备工具。为筛选出效果理想的高脂血症动物模型造模方法，观察不同时间小鼠血脂的变化情况，以期待筛选出一种既经济稳定又省时省力的高脂血症小鼠动物模型的造模方法，为后续研究奠定基础。pedf又称色素上皮来源衍生因子serpinf1，是分泌性糖蛋白，属于丝氨酸蛋酶抑制剂超家族成员之一，具有明确的抑制血管新生、保护内皮和营养神经的作用与功能。不仅如此，pedf还被证实是非常重要的脂代谢调节分子，临床研究数据显示，与正常人群相比，肥胖、代谢综合征和糖尿病患者外周血pedf水平明显增高，而且其浓度还与甘油三酯浓度呈正相关，与高密度脂蛋白浓度呈负相关。目前应用crispr/cas9基因修饰技术构建pedf-/-小鼠，高脂饮食(hfd)诱导肥胖小鼠模型。发现随着高脂诱导时间的延长，pedf-/-小鼠的体重随之增加，肥胖程度以及血清脂代谢(tg、tc、ldl和hdl)相对与高脂诱导的正常小鼠具有显著性的差异。但是，虽然在早期hfd诱导时，pedf血清浓度确实相比对照组正常饮食表达升高，在0、4周、8周、12周和16周时，血清中pedf浓度一直升高；可是在后期(24周时)血清中pedf表达水平下降，延续观察，pedf血清中pedf表达相对于对照组表达水平降低(24周、36周和48周)。这暗示着pedf其实在早期肥胖的过程中升高原因有可能机体为了平衡体内的脂代谢一种代偿性升高的机制，而在后期由于脂代谢紊乱的加剧，促使动脉的结构功能受损，高脂血症以及外周组织的脂质沉积以及损伤，促使pedf代偿性机制失调。因此缺乏一种更加经济、省时、省力、成功率更高的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型及构建方法。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种更为经济有效的高脂血症以及动脉粥样硬化小鼠模型。本发明的第一个目的是提供apoe基因和pedf基因的组合作为构建高脂血症和/或动脉粥样硬化的动物模型中的靶位点的应用。本发明的第二个目的是提供一种高脂血症和/或动脉粥样硬化的动物模型。本发明的第三个目的是提供任一所述动物模型的制备方法。本发明的第四个目的是提供所述动物模型在研究心血管疾病和/或脂代谢紊乱中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：本发明是以c57b6小鼠为背景，以apoe-/-小鼠和相同背景的pedf-/-进行杂交，得到的纯合的apoe-/-/pedf-/-小鼠，在取相同周龄大小的apoe-/-雄性小鼠进行比较，分别进行了相同高脂诱导得到高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型。高脂诱导24周、36周和48周后：(1)apoe-/-/pedf-/-小鼠在体重以及附睾的脂肪垫与apoe-/-小鼠相比都显著增大；pet/ct腹部脂肪扫描显示apoe-/-/pedf-/-小鼠在腹部沉积更多的脂肪；血清血脂水平tg、tc、ldl都显著性地增高形成更严重的高脂血症，血脂hdl下降，具有统计差异；说明高脂诱导apoe-/-/pedf-/-小鼠比传统的高脂诱导apoe-/-小鼠能得到更好的高脂血症小鼠工具鼠，可以节省高脂诱导时间，得到与传统诱导高脂血症模型同效价的诱导效果，经济效益更高。(2)apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠收缩压显著性升高，舒张压和平均脉压在24周升高而在36周和48周升高不是特别显著；血管顺应性指标脉搏波显示，高脂诱导分别24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠pwv显著性升高，表明apoe-/-/pedf-/-小鼠的血管顺应性更差，僵硬度高。(3)在病理学研究中，整体主动脉油红染色，apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠血管的斑块面积显著升高，而在主动脉横截面积的切片结果也显示，apoe-/-/pedf-/-小鼠血管斑块面积更大，血管更狭窄。总之，apoe-/-/pedf-/-小鼠相对于传统高脂诱导apoe-/-小鼠具有更严重的动脉粥样硬化的特性，是很好的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型。因此本发明要求保护以下内容：apoe基因和pedf基因的组合作为构建高脂血症和/或动脉粥样硬化的动物模型中的靶位点的应用。其中，apoe基因为ncbi数据库中geneid:11816的基因。pedf基因为ncbi数据库中geneid:20317的基因。一种高脂血症和/或动脉粥样硬化的动物模型，同时敲除动物的apoe基因和pedf基因。优选地，所述动物为小鼠。优选地，所述动物为小鼠为c57bl/6j小鼠。本发明还要求保护任一所述动物模型的制备方法，用敲除apoe基因的纯合动物和敲除pedf基因的纯合动物杂交，之后进行自交，筛选得到，同时敲除动物的apoe基因和pedf基因的动物。优选地，筛选得到的同时敲除动物的apoe基因和pedf基因的动物进行高脂诱导。优选地，所述动物为小鼠，6～8w开始进行高脂诱导。优选地，所述高脂诱导为采用的高脂饲料为型号d12492高脂饲料进行高脂的诱导。所述动物模型在研究心血管疾病和/或脂代谢紊乱中的应用，也属于本发明的保护范围。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明建立了一种更加经济、省时、省力、成功率更高的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法。本发明构建的高脂诱导的高脂血症以及动脉粥样硬化小鼠模型效果更明显的高脂血症以及动脉粥样硬化症状：在血清学生化指标效果更显著的高脂血症，血清脂代谢(tg、tc、ldl和hdl)紊乱更严重；在外形、体重、附睾的脂肪垫以及pet/ct影像更明显的肥胖；表现更明显的血管的功能的下降；动脉粥样斑块面积更大血管狭窄更严重，血管的功能受损更严重。并且，可以节省高脂诱导时间，得到与传统诱导高脂血症模型同效价的诱导效果，经济效益更高。构建的小鼠模型为研究心血管疾病的机制功能研究以及治疗心血管疾病药物的研发、试验、临床研究应用以及药物的筛选提供更加经济有效的模型。附图说明图1为apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠与同周龄apoe-/-雄性小鼠分别喂养24周、36周和48周的大体图片和体重的统计图，结果显示apoe-/-/pedf-/-小鼠从外形相比更肥胖，体重也显著性增加。(&&&p<0.001,0.05<&&p<0.001)图2为附睾脂肪垫的重量和pet/ct腹部脂肪扫描图以及腹部脂肪体脂率的统计图结果，结果显示apoe-/-/pedf-/-小鼠附睾脂肪垫的重量显著性地增加，ct结果显示腹部脂肪沉积增加，并且体脂率统计结果显示，apoe-/-/pedf-/-小鼠的脂肪堆积增加(&&&p<0.001,0.05<&&p<0.001,&p<0.05同apoe-/-小鼠比较)。图3为apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠与同周龄apoe-/-雄性小鼠分别喂养24周、36周和48周的收缩压b舒张压c平均脉压的比较，结果显示apoe-/-/pedf-/-小鼠的收缩压显著性升高，舒张压以及平均脉压增大不显著(&&&p<0.001,&p<0.05)。图4为利用超声多普勒对apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠与同周龄apoe-/-雄性小鼠分别喂养24周、36周和48周的升主动脉的血流峰和降主动脉的血流峰测量，结果显示apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠都显著性升高(0.05<&&p<0.001,&p<0.05同apoe-/-小鼠比较)。图5为通过多普勒检测两组小鼠的脉搏波，结果显示，与apoe-/-小鼠比较，apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠都显著性升高(0.05<&&p<0.001,&p<0.05同apoe-/-)小鼠比较)。图6为apoe-/-/pedf-/-雄性小鼠与同周龄apoe-/-雄性小鼠分别喂养24周、36周和48周的整体主动脉油红染色以及斑块面积统计，结果显示apoe-/-/pedf-/-小鼠斑块面积显著性的增多(0.05<&&p<0.001,&p<0.05同apoe-/-小鼠比较)。图7为横截面的斑块面积油红染色以及统计图，结果显示apoe-/-/pedf-/-小鼠横截面积斑块面积显著性增多，血管更狭窄(&&&p<0.001,0.05<&&p<0.001,&p<0.05同apoe-/-小鼠比较)。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。pedf-/-小鼠为c57bl/6j背景，由美国oklahomauniversity的马建兴教授课题组构建，并由中山大学中山医学院高国全教授课题组友情赠送。apoe-/-小鼠为c57bl/6j背景购买于南京模式动物中心。本发明所用实验动物均在中山大学疾病模式动物中心进行扩繁。实施例1apoe-/-pedf(-/-)小鼠的获得一、实验方法本发明以pedf-/-小鼠与apoe-/-小鼠进行杂交，得到子代apoe+/-pedf+/-小鼠，在对其进行自交得到的子代进行鼠尾基因组pcr鉴定(通过特定引物分别对小鼠个体基因组apoe和pedf进行鉴定)，鉴定结果得到apoe-/-/pedf-/-纯合小鼠，并再对其进行扩繁。具体鉴定方法为：分别取1～2cm小鼠尾巴，通过takara组织基因组提取试剂盒提取鼠尾的基因组dna。采用takarapcr试剂盒，通过特定检测引物如下对apoe和pedf进行pcr鉴定，并以野生型进行对照。表1双敲小鼠的引物序列：表2pcr反应体系：5xonetaqpcrbuffer2μlonetaq酶0.2μldna模板12μlpcr上游引物0.5μlpcr下游游引物0.5μlddh2o5.8μltotal10μlpcr反应条件为：预变性：95℃3min；98℃10s,55℃30s,72℃45s,35个循环；72℃5min,4℃∞。再对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。二、实验结果pedf基因检测突变目的片段为500bp，野生型目的片段为350bp，pedf杂合小鼠pcr产物存在两个目的条带分别是500bp和350bp.apoe基因检测突变片段为245bp，野生型的片段为155bp，apoe杂合小鼠pcr产物存在两个目的片段分别为245bp和155bp。当小鼠个体满足两个条件：pedf基因检测目的片段只有唯一的500bp条带和apoe基因检测目的片段只有唯一的245bp条带即得到双敲小鼠。实施例2高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型的构建实施例1获得的apoe-/-/pedf-/-小鼠，于4周雄雌小鼠进行分笼，并进行随机分组，每组5～10只，于6～8周开始进行持续采用高脂诱导，期间自由饮水饮食，每12小时照明交替，温度21±2℃，湿度40～70％。在前期观察中，我们发现在4～16周，小鼠体型双敲小鼠都比apoe-/-小鼠显著肥胖。然而，由于高脂饲料(肥胖型诱导的高脂饲料)成分的关系，我们在前期的预实验发现在在高脂诱导至24周左右小鼠形成动脉斑块，因此取小鼠高脂诱导24周之后的时间段，并对小鼠进行取材，对主动脉斑块进行油红染色检测，后续再继续延长高脂诱导观察小鼠动脉粥样的进程。具体诱导方式为：采用的高脂饲料为型号d12492高脂饲料，高脂饲料成分含量中脂肪能量比占60％，蛋白和碳水化合物能量比分别占20％，购买于广东省医学实验动物中心。获得的纯合apoe-/-/pedf-/-小鼠在周龄6～8周时，开始进行高脂的诱导。因为还观察动脉粥样硬化的进展，所以持续高脂诱导直至24周、36周和48周，饥饿处理8小时，对小鼠进行分别取血、取材以及体内血管功能的检测。选择同周龄apoe-/-小鼠作为对照，进行同样的高脂诱导。实施例3血症及动脉粥样硬化小鼠模型的血清脂代谢生化指标检测一、实验方法高脂诱导24周、36周和48周后，分别采取三个时间的实施例2中的apoe-/-/pedf-/-小鼠和对照apoe-/-小鼠的血清，通过生化检测试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所)：甘油三酯(tg，a110-1-1)测定试剂盒、总胆固醇(tc，a111-2-1)测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c，a113-1-1)测定试剂盒、高密度胆固醇(hdl-c，a112-1-1)和游离脂肪酸试剂盒(ffa，a042-1-1)测定试剂盒分别检测小鼠血清的tg、tc、ldl、hdl和ffa的浓度。二、实验结果结果如表1所示，高脂诱导24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠在相同时间点血清学检测tg、tc和ldl相对与apoe-/-小鼠分别都显著性升高，而hdl指标在相同时间点相对于apoe-/-小鼠显著性降低。表3两组高脂饮食小鼠不同时间点的血清脂代谢生化指标比较：实施例4血症及动脉粥样硬化小鼠模型的肥胖情况一、实验方法高脂诱导24周、36周和48周后，分别检测三个时间的实施例2中的apoe-/-/pedf-/-小鼠和对照apoe-/-小鼠的体重、取材附睾上的脂肪垫，以及采集三个时间点的外形图片，并且利用pet/ct以24周为时间点观察两组小鼠腹部的脂肪沉积。pet/ct的具体步骤为：对小鼠进行麻醉，ct扫描小鼠整个腹部的脂肪，利用图像软件调节图像灰度为-50～-250u,直至看见实质性器官为深色，脂肪为浅灰色。对图像小鼠腹部脂肪进行统计分析。二、实验结果结果如图1和2所示，高脂诱导24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠相比于apoe-/-小鼠在外形显示更肥胖，并且在相对应的高脂诱导时间点上，apoe-/-/pedf-/-小鼠附睾上的脂肪垫的重量更大，具有统计学意义。而在以24周为观察的时间点，pet/ct影像中显示apoe-/-/pedf-/-小鼠具有明显的腹部的脂肪的沉积。实施例5血症及动脉粥样硬化小鼠模型的血管功能的检测一、实验方法高脂诱导24周、36周和48周后，利用小动物血管多普勒仪器分别检测三个时间点apoe-/-/pedf-/-小鼠和对照apoe-/-小鼠的主动脉和腹主动脉的血流峰以及两个位置的距离检测小鼠血管的脉搏波，评价小鼠血管的僵直度。利用小鼠无创鼠尾血压仪分别测三个时间点apoe-/-/pedf-/-小鼠与对照apoe-/-小鼠的血压。利用高频超声多普勒观察两组小鼠三个时间点在升主动脉以及降支主动脉的血流速度评价小鼠血管的弹性收缩能力。具体方法：对小鼠进行麻醉，利用小动物血管多普勒仪器使用多普勒设置模块，勾选f/rnoti/q模块，采用两个20hz探头，分别插入通道a和通道b，将小鼠四肢连接到可加热的电极板上，连接平板，将电极板的温度调节37℃，平板打开多普勒软件，观察心电图是否正常，选择相应的导联。打开a通道，利用探头15度检测小鼠近胸骨出的主动脉的血流峰。转接b通道，利用探头垂直检测腹部检测腹部主动脉的血流峰。用量尺量两个探头检测信号的垂直距离(s),软件出现主动脉血流峰(t1)和腹主动脉出现的血流峰(t2)，利用公式算出脉搏波(pwv＝s/(t1-t2))。利用无创血压仪分别测三个时间点的小鼠的血压，进行比较。利用高频超声多普勒，对小鼠用5％的异戊烷进行气体麻醉。二、实验结果结果如图3到5所示，高脂诱导24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠在apoe-/-小鼠喂养高脂相同时间点相比，脉搏波速度分别显著增大，证明其血管的顺应性更差，血管功能的下降。而在小鼠血压，在相应的时间点相比，24周、36周和48周收缩压都显著地增大，而在舒张压以及平均脉压增长不明显；而在升主动脉以及降支主动脉的血流速度apoe-/-/pedf-/-小鼠在apoe-/-小鼠喂养高脂相同时间点相比，apoe-/-/pedf-/-小鼠显示比apoe-/-小鼠血流增速，表明apoe-/-/pedf-/-小鼠相对于apoe-/-小鼠喂养相同高脂时间，在血管功能表现出更严重地顺应性差、血管僵直度大、功能地下降。实施例6血症及动脉粥样硬化小鼠模型的动脉粥样斑块面积检测一、实验方法高脂诱导24周、36周和48周后，分别取出整体主动脉进行整体油红染色和横切面的油红染色，并对血管的斑块的面积进行统计。具体操作如下：对小鼠进行拍照，称量体重。在取样前一天对小鼠进行禁食不禁水12h，第二天对小鼠进行麻醉，摘眼球取血，打开胸腔，利用pbs对心脏左心室心尖进行灌注，直到肺脏肝脏变白，细心地取出肝脏总体，附睾的脂肪垫，心脏以及心脏连接的动脉(胸主动脉至髂主动脉的分叉处)，小鼠大腿的肌肉。对附睾的脂肪垫进行称重。取出的血样在室温放置一小时左右，对血样进行离心，3000rpm15分钟。进行分装，放置在-80℃，等待检测。利用生化检测试剂盒tg、tc、ldl和hdl分别检测相应的指标，进行统计计算。整体血管的油红染色，称量0.625g油红粉末，用100毫升异丙醇进行溶解，用搅拌子进行搅拌2小时，配成存储浓度。使用前，对储存液进行油红储存液2:3高压灭菌水进行稀释。用眼科镊和剪子小心剥离血管外部的脂肪，直至剥离干净，血管呈透明色，用眼科剪沿着血管小心剪开，摊开在滤纸上，对折滤纸，放入60％异丙醇预染2～5分钟，在放入油红工作液染3～4小时,放置在水平摇床摇。放入60％异丙醇洗去多余的油红液，分化直至无斑块面积的血管呈现透明色，然后放置在灭菌高压蒸馏水里面，利用黑色硅胶板进行展示，拍照，并利用软件进行统计计算。取材对主动脉升主动脉弓2～3cm进行横切面切片，切片厚度为8nm，进行油红染色，异丙醇进行分化，并进行切片苏木素染色，染30～45秒，盐酸酒精分化，利用甘油明胶进行封片，拍照并进行统计。二、实验结果结果如图6和7所示，高脂诱导24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠显示比apoe-/-小鼠的整体主动脉斑块面积更显著，尤其是在主动脉弓的斑块面积。在主动脉弓的横切面油红染色观察到横切面血管斑块面积apoe-/-/pedf-/-小鼠更显著，血管更狭窄。综上所述，同周龄的apoe-/-/pedf-/-小鼠和对照apoe-/-小鼠分别进行了相同高脂诱导24周、36周和48周后。(1)apoe-/-/pedf-/-小鼠在体重以及附睾的脂肪垫与apoe-/-小鼠相比都显著增大；在pet/ct腹部脂肪扫描，apoe-/-/pedf-/-小鼠在腹部沉积更多的脂肪；血清血脂水平tg、tc、ldl都显著性地增高更严重的高脂血症，血脂hdl下降，具有统计差异。说明高脂诱导apoe-/-/pedf-/-小鼠比传统的高脂诱导apoe-/-小鼠能得到更好的高脂血症小鼠工具鼠，可以节省高脂诱导时间，得到与传统诱导高脂血症模型同效价的诱导效果，经济效益更高。(2)apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠收缩压显著性升高，舒张压和平均脉压在24周升高而在36周和48周升高不是特别显著；血管顺应性指标脉搏波发现，高脂诱导分别24周、36周和48周后，apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠pwv显著性升高，表明apoe-/-/pedf-/-小鼠的血管顺应性更差，僵硬度高。(4)在病理学研究中，整体主动脉油红染色，apoe-/-/pedf-/-小鼠相比较于apoe-/-小鼠血管的斑块面积显著升高，而在主动脉横截面积的切片结果也显示，apoe-/-/pedf-/-小鼠血管斑块面积更显著，血管更狭窄。总之，apoe-/-/pedf-/-小鼠相对于传统高脂诱导apoe-/-小鼠具有更严重的动脉粥样硬化的特性，是很好的高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型。当前第1页1 2 3