本发明涉及农业生产技术领域，特别涉及一种一种硫添加对土壤水稻系统中砷迁移转化的影响机制的研发方法。
背景技术：
硫（s）是植物的生长发育过程中所必需的大量元素之一，并且，硫的氧化还原过程能直接或间接的影响土壤中重金属的生物有效性。在缺乏硫的情况下，水稻的生长发育会受到严重影响，其抗逆性显著降低。水稻对重金属的吸收积累很大程度上依赖于重金属在根际微环境中的形态及生物有效性。因此，调控硫在土壤中的含量和存在形态，对阻控水稻中重金属的过量积累有重要意义。
已有一些研究表明，外源添加硫素，可以通过提高水稻体内的硫醇代谢和增强抗氧化系统以减少水稻对砷的吸收积累。但关于硫在稻田土壤中如何影响砷的存在形态从而影响水稻对砷的吸收积累的机制尚未完全清楚。在稻田土壤中，丰富的铁的存在使得砷、硫、铁三者间的生物化学循环更为复杂。硫的施用能增加水稻根表铁膜含量，并且，在还原性环境中，增加硫酸盐含量可减少三价铁、五价砷的异化还原。土壤和根际微生物在还原性土壤的硫形态转化和砷的根系吸收等方面起着重要作用。土壤中砷的存在状态受土壤酸碱度、氧化还原电位和铁锰氧化物等条件显著影响，而单质硫、石膏的施用必定会引起土壤ph、eh等的改变，进而改变砷的氧化-还原、吸附-解吸、沉淀-溶解、甲基化-脱甲基以及生物富集等进程，同时影响铁锰胶膜含量，由此影响砷的活性及生物可利用性。
目前关于施用不同形态硫素对水稻生长发育的影响已有大量研究，也有不少关于施用硫素对砷污染下土壤-水稻中砷的吸收、积累与分布影响的研究。但在探索不同形态硫素施用对土壤-水稻体系中砷分布与转移的影响方面还没有较为明确的结果。为此需要一种硫添加对土壤水稻系统中砷迁移转化的影响机制的研发方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理的硫添加对土壤水稻系统中砷迁移转化的影响机制的研发方法。本研究拟施用不同形态的硫素，模拟水稻砷污染实验，通过分析和评估不同形态的硫对根际环境中砷的生物可利用性，为探寻降低水稻吸收积累砷的农艺技术措施、保障食品安全提供理论依据。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：它的操作步骤如下：
步骤1、水稻品种选择
水稻种子选自特优524（以下简称ty524）。
步骤2、实验土壤准备
本试验供试土壤选自外源添加的as污染土。外源添加的as污染土：土壤采自河南省信阳市新县无污染水稻土（0-20cm），该土壤本底as浓度为（12.5土0.02）mg·kg-1。将采回的稻田土风干磨碎，在土壤中添加60mg·kg-1的as（以na3aso4的形式），采用喷雾法将na3aso4·12h2o溶液喷洒至土壤中，使得重金属溶液与土壤混合均匀。混合后的土壤按每千克土2g复合肥的标准添加底肥，充分混匀后平衡一个月备用。
步骤3、水稻种植
将所选的水稻种子晾晒两天，然后用30%的h2o2浸泡15分钟，用自来水冲洗三遍至完全干净，再放入培养皿加满水浸泡两天，然后将破胸露白的种子转移到事先准备好的无污染土中育苗30天。选取大小一致的幼苗移栽到根际袋（300目，高15cm×直径8cm）中，每袋两株幼苗。设置3组处理：a.移栽前加入120mg·kg-1na2so4；b.移栽前加入120mg·kg-1单质硫（s）；c.对照组。每组作4个重复，株距20cm，行距20cm，所有重复随机分布。常规管理水稻，如定期灌水、排水、施肥、除草、防虫害。12月末进入成熟期，将植物以自来水清洗干净并且按根、茎叶、籽粒等各部分分别收集。茎叶、籽粒样品于60℃烘箱烘干，经不锈钢粉碎机粉碎待测；根用滤纸吸干水分后保存于-20℃冷库中待测。根际袋中的土样被认为是根际土，统一采集表层3cm以下的土样，冻干后过20目筛，于-20℃冷库中保存待用。
步骤4、土壤中砷的连续提取及分析
取出根际土，过80目筛，从中称取0.4000g土壤样品入离心管。加入10ml0.05mol·l-1（nh4）2so4，在室温下震荡4h。震荡结束后在8000rpm下离心10min，取上清，得f1非特异性吸附态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.05mol·l-1nh4h2po4，在室温下震荡16h，震荡结束后8000rpm下离心10min。取上清，得f2特异性吸附态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.2mol·l-1草酸铵缓冲液（ph=3），在室温下震荡4h，然后8000rpm下离心10min。取上清，得f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.2mol·l-1草酸铵和0.1mol·l-1抗坏血酸混合溶液（ph=3），在96℃水浴下振荡30min，然后8000rpm下离心10min。取上清，得f4晶质铁铝水合氧化物结合态砷溶倒上清。剩下的沉淀于60℃烘箱烘干，转移到消化管中，加入5ml王水140℃消化9h，赶酸至消化管内剩0.5ml溶液，过滤，最后定容到25ml，得f5残渣态砷溶液。利用原子荧光光谱仪（afs）测定各溶液中砷含量。
步骤5、植物样品中砷的分析
茎叶、籽粒、根消化体系为hno3（优级纯），140℃消解9h，赶酸至消化管内剩0.5ml溶液，过滤，定容至15ml，4℃保存。利用原子荧光光谱仪（afs）测定溶液中砷含量。
步骤6、水稻根表铁膜测定
将0.6g保险粉（连二亚硫酸钠）加入30ml含0.03mol·l-1的柠檬酸钠和0.125mol·l-1的碳酸氢钠的溶液中，制成dcb提取液。将水稻根用超纯水冲洗干净，浸入到30mldcb提取液中，25℃下提取2h，过滤，定容到50ml，4℃保存。用电感耦合等离子发射光谱仪（icp-oes）测定其中铁、锰含量。利用afs测定溶液中砷含量。
步骤7、数据分析
利用spss22.0软件进行单因素方差分析（ano-va），处理样品以及对照中不同数值之间的显著性差异分析通过leastsignificantdifference（lsd）检测法进行测定。所得数据均为3个平行的平均值±标准差。
进一步的，所述步骤（2）中复合肥由如下成分组成：去离子水、氮磷钾的施入量分别为p2o5[ca（h2po4）2]0.5g·kg-1，n[co（nh2）2]和k2o（kcl）各0.2g·kg-1。
本发明的优点和积极效果是：
1.本研究探讨了在不同硫素添加条件下水稻植株内不同部分对砷的吸收积累，以及根际土中砷的各种形态含量，试图了解硫对水稻砷积累的影响及机理，希望能够为解决如今大面积稻田砷污染问题提供数据支持，为以后的研究提供理论依据。
2.根据测定结果可生产出有利于降低水稻砷吸收的新型化肥。
3.根据测定结果可提供在砷污染稻田种植水稻的新方法。
4.根据测定结果可提供在砷污染稻田种植水稻的品种筛选新思路。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详述。
步骤1、水稻品种选择
水稻种子选自特优524（以下简称ty524）。
步骤2、实验土壤准备
本试验供试土壤选自外源添加的as污染土。外源添加的as污染土：土壤采自河南省信阳市新县无污染水稻土（0-20cm），该土壤本底as浓度为（12.5土0.02）mg·kg-1。将采回的稻田土风干磨碎，在土壤中添加60mg·kg-1的as（以na3aso4的形式），采用喷雾法将na3aso4·12h2o溶液喷洒至土壤中，使得重金属溶液与土壤混合均匀。混合后的土壤按每千克土2g复合肥的标准添加底肥，每桶土称重2.5kg（以干重记），充分混匀后平衡一个月备用。复合肥由如下成分组成：去离子水、氮磷钾的施入量分别为p2o5[ca（h2po4）2]0.5g·kg-1，n[co（nh2）2]和k2o（kcl）各0.2g·kg-1。
步骤3、水稻种植
将所选的水稻种子晾晒两天，然后用30%的h2o2浸泡15分钟，用自来水冲洗三遍至完全干净，再放入培养皿加满水浸泡两天，然后将破胸露白的种子转移到事先准备好的无污染土中育苗30天。选取大小一致的幼苗移栽到根际袋（300目，高15cm×直径8cm）中，每袋两株幼苗。设置3组处理：a.移栽前加入120mg·kg-1na2so4；b.移栽前加入120mg·kg-1单质硫（s）；c.对照组。每组作4个重复，株距20cm，行距20cm，所有重复随机分布。常规管理水稻，如定期灌水、排水、施肥、除草、防虫害。12月末进入成熟期，将植物以自来水清洗干净并且按根、茎叶、籽粒等各部分分别收集。茎叶、籽粒样品于60℃烘箱烘干，经不锈钢粉碎机粉碎待测；根用滤纸吸干水分后保存于-20℃冷库中待测。根际袋中的土样被认为是根际土，统一采集表层3cm以下的土样，冻干后过20目筛，于-20℃冷库中保存待用。
步骤4、土壤中砷的连续提取及分析
取出根际土，过80目筛，从中称取0.4000g土壤样品入离心管。加入10ml0.05mol·l-1（nh4）2so4，在室温下震荡4h。震荡结束后在8000rpm下离心10min，取上清，得f1非特异性吸附态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.05mol·l-1nh4h2po4，在室温下震荡16h，震荡结束后8000rpm下离心10min。取上清，得f2特异性吸附态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.2mol·l-1草酸铵缓冲液（ph=3），在室温下震荡4h，然后8000rpm下离心10min。取上清，得f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷溶液。剩下的沉淀用10ml超纯水润洗，再在室温下震荡10min，然后8000rpm下离心10min。倒上清。剩下的沉淀加入10ml0.2mol·l-1草酸铵和0.1mol·l-1抗坏血酸混合溶液（ph=3），在96℃水浴下振荡30min，然后8000rpm下离心10min。取上清，得f4晶质铁铝水合氧化物结合态砷溶倒上清。剩下的沉淀于60℃烘箱烘干，转移到消化管中，加入5ml王水140℃消化9h，赶酸至消化管内剩0.5ml溶液，过滤，最后定容到25ml，得f5残渣态砷溶液。利用原子荧光光谱仪（afs）测定各溶液中砷含量。
步骤5、植物样品中砷的分析
茎叶、籽粒、根消化体系为hno3（优级纯），140℃消解9h，赶酸至消化管内剩0.5ml溶液，过滤，定容至15ml，4℃保存。利用原子荧光光谱仪（afs）测定溶液中砷含量。
步骤6、水稻根表铁膜测定
将0.6g保险粉（连二亚硫酸钠）加入30ml含0.03mol·l-1的柠檬酸钠和0.125mol·l-1的碳酸氢钠的溶液中，制成dcb提取液。将水稻根用超纯水冲洗干净，浸入到30mldcb提取液中，25℃下提取2h，过滤，定容到50ml，4℃保存。用电感耦合等离子发射光谱仪（icp-oes）测定其中铁、锰含量。利用afs测定溶液中砷含量。
步骤7、数据分析
利用spss22.0软件进行单因素方差分析（ano-va），处理样品以及对照中不同数值之间的显著性差异分析通过leastsignificantdifference（lsd）检测法进行测定。所得数据均为3个平行的平均值±标准差。
结果与分析：
1.不同形态硫肥对砷形态的影响
结果显示，土壤as的形态以f1非特异性吸附态砷所占比例为2.2%～5.3%，f2特异性吸附态砷所占比例为32.1%～36.5%，f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷所占比例为29.2%～39.5%，f4晶质铁铝水合氧化物结合态砷所占比例为11.8%～15.2%；f5残渣态砷所占比例为9.6%～22.3%。f2和f3所占比例达到61.3%～76.0%，f1所占比例最低。
在根际土壤中，s处理下土壤as化学形态变化较小，而na2so4处理下，土壤中的非专性吸附态、专性吸附态、无定形铁氧化物态、晶体铁氧化物态as均显著降低，而残渣态as显著升高（p<0.05）。
土壤砷形态分级能够反映砷的潜在移动性、生物有效性及污染危害水平等信息。其中，f1非特异性吸附态砷易被生物吸收，危害性较大；f2特异性吸附态砷和f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷均可能在土壤理化条件改变时被释放成为有效态砷，而f4晶质铁铝水合氧化物结合态砷和f5残渣态砷则不易释放和被生物吸收，危害性较低。本研究表明在根际土壤中，硫肥的添加降低了生物有效性利用度较高的几种形态，促进as向稳定态的转化。
2.不同形态硫肥对水稻生长的影响
结果显示，硫肥的添加对水稻地下部分的株高没有显著影响，而地上部分的长度均显著增加，s和na2so4处理分别使水稻地上部分的长度与对照组相比增加了19.5％和12.4％（p<0.05），—定程度上促进了水稻地上部分的增长。硫素的添加对水稻鲜重具有一定的促进作用。硫素的添加显著增加了地上部鲜重，经s和na2so4处理与对照组比较，分别增加了20.5%和28.1%（p<0.05）。
s和na2so4能明显提高as污染下水稻地上部株高及水稻鲜重，说明通过施用s肥能够缓解as对水稻生长发育的毒害作用。整体上施用单质硫与na2so4处理间没有显著差异，但单质硫效果要稍好于na2so4，这可能是因为单质硫属于还原性物质。
3.硫素对as在水稻植株体中分布的影响
结果显示，在所有处理中，水稻根部的as含量最高。不同部位水稻as的累积量排序大致为根>叶>茎>谷壳>米粒。硫素添加对水稻根as的累积没有显著影响。单质硫的添加显著降低水稻茎中as的累积，降低30.2%（p<0.05），而硫酸钠的添加没有显著影响（p>0.05）。硫素添加显著降低水稻叶中as的累积，并且硫酸钠的添加使水稻叶和茎的累积量发生了改变，对照组处理中叶>茎，而硫酸钠处理中叶≈茎。硫素的添加并没有对谷壳中的as产生影响。
s可通过改变水稻根际环境ph、氧化还原状态等影响水稻对as的吸收，以及as在水稻植株内的运输转移。以上结果表明，施用s肥能明显降低水稻地上部茎叶以及籽粒中as的含量，并且施用单质硫效果较硫酸钠更好。
4.硫肥对水稻根表胶膜胶膜元素含量及对as吸附量的影响
结果显示，水稻根系表面的铁锰氧化物胶膜以fe膜为主，mn膜相对较少（p>0.05）。s施入能增加水稻根系表面铁锰胶膜的含量。单质硫能促进fe膜的形成，对mn膜则有一定的抑制作用（p>0.05）。
硫素的施用一定程度上降低根际土壤溶液中的as和fe，降低as的移动性；土壤溶液中的as也有一定程度的降低；硫素的添加显著降低了根际土壤中as有效态；相同硫含量的硫酸钠比单质硫的影响更显著（p<0.05）。
单质硫的添加显著增加了根表胶膜fe的含量（p<0.05），硫酸钠的添加增加fe的含量但没有达到显著水平（p>0.05）。不同硫素的添加均显著增加水稻根表胶膜as和fe呈极显著正相关（r=0.828，p<0.01）。硫素的添加显著增加了根表胶膜中的s，并且s与as（r=0.831，p<0.01）和fe（r=0.876，p<0.01）均呈极显著正相关。硫素的添加促进了水稻根表胶膜的形成，增加了as在根际环境和水稻根表的固持。
5.相关关系分析
将根际土壤溶液化学形态与水稻吸收as进行相关性分析，考察影响水稻as吸收的因素。根表胶膜中的fe和s均与水稻叶片中的as显著负相关（p<0.05）。土壤溶液中的as也与水稻as吸收有一定的相关关系，土壤溶液中的总as与水稻米粒中的as显著负相关，as与水稻茎和叶中的as显著正相关。土壤中as的化学形态与水稻吸收as及土壤溶液中as和fe的移动性也具有一定的显著相关关系。
在土壤中，f1非特异性吸附态砷、f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷as均与土壤溶液中的fe显著正相关，其中f3非晶形或弱晶形铁铝水合氧化物结合态砷as与土壤溶液中的as也显著正相关，表明这些形态在培养过程中并不稳定，是fe还原溶解的主要部分，而残渣态as与土壤溶液中的as和fe呈显著负相关关系，表明在添加as的污染土壤中仅残渣态为as稳定态。硫素的添加显著降低根际土壤中的非稳定态，降低根际as有效态，从而缓解as对植物毒性。
通过上面的研究，证明本发明的研发方法是可行的，为探寻降低水稻吸收积累砷的农艺技术措施、保障食品安全等提供理论依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。