一种角膜透镜超低温长期保存方法与流程

本发明涉及一种角膜透镜超低温长期保存方法。

背景技术：

角膜病是我国第二位致盲眼病，根据世界卫生组织统计，全世界约6000万角膜疾病患者；其中我国现有约500万角膜盲患者，并且每年角膜盲病人新增15多万人。角膜移植仍然是恢复视力的主要手段，然而我国角膜材料严重匮乏，与庞大的需求相比，杯水车薪。目前已有两种脱细胞猪角膜产品被中国食药局批准，但临床应用后移植物透明度不佳，视力恢复延迟。

飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(smallincisionlenticuleextraction，smile)是近年来角膜屈光手术领域最大的发展之一，用于近视及散光的矫正，具有极高的安全性、有效性、稳定性及可预测性。这部分在角膜基质层内取出的组织我们称为“角膜透镜”。smile角膜组织透镜来源非常丰富，国内每年开展smile手术约一百万台，然而smile手术中取出的角膜透镜这一“副产品”往往被拋弃，并未得到有效的利用。角膜透镜预期可用于矫正远视和近视、治疗老视，以及用于治疗圆锥角膜、角膜营养不良、角膜溃疡、角膜穿孔、边缘角膜变性(周边角膜的免疫性、非感染性疾病)、角膜基质变薄等角膜疾病，以及利用其构建组织工程化生物角膜的载体等。

目前角膜组织的保存方法有：传统甘油冷冻保存、角膜保存液低温中期保存不超过三周、化学脱水低温保存、纯甘油常温保存。甘油保存后的角膜组织硬度增加严重、透明度降低、复水后变脆；化学脱水法易被微生物感染；再者大部分研究对象均聚集在全角膜或脱细胞板层角膜，以上其均限制了在角膜透镜保存中的广泛应用。

尽管角膜是免疫赦免组织，同种异体角膜透镜移植仍有可能发生免疫排斥反应，目前角膜透镜的脱细胞方法并不成熟，因此降低角膜透镜的抗原性尤为重要。

由于角膜透镜具有广泛的临床应用前景，目前专门针对角膜透镜保存方面研究甚少，前期公开的有关角膜组织长期保存的保存液只是报道了全角膜的效果，而针对角膜透镜实际的保存效果未见报告。针对以上的问题，开发一种角膜透镜的超低温长期保存方法，能够维持角膜原有的胶原纤维结构和透明性、降低组织的抗原性，适用于角膜组织移植术，以满足市场的需要。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种角膜透镜超低温长期保存方法。

技术方案：本发明所述的技术方案是这样的，一种角膜透镜超低温长期保存方法，将角膜透镜保存液无菌分装至无菌冻存管后，将冲洗后的角膜透镜冲洗后转移至冻存管中，然后将冻存管置于程序降温盒中，放置到-60℃～-80℃深低温冰箱进行程序降温并过夜，使用的程序降温盒的降温速度应≤1℃，将冻存管取出放置预冻的冻存盒中，再放置到-196℃液氮中进行保存。

优选地，具体包括以下步骤：

a、收集和处理：将smile手术取出的角膜透镜收集在装有无菌角膜透镜保存液的透明瓶中，密封后室温浸泡时间30min～240min；

b、首检：通过透明瓶外部检查角膜透镜外观，其中外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷，首检合格后方可进入下一步操作；

c、冲洗：在无菌操作条件下，使用专用的无菌转移环取出角膜透镜，并用无菌等渗磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗角膜透镜表面，冲洗时间2min～30min；

d、转移：将角膜透镜保存液无菌分装至2ml无菌冻存管中，分装量2ml，然后将冲洗后的角膜透镜冲洗后转移至冻存管中，旋紧外盖，并进行标记；

e、检验：倒置冻存管并来回翻转，确保无外漏；

f、程序降温：将检验合格的装有角膜透镜的冻存管装进程序降温盒中，放置到-60℃～-80℃深低温冰箱进行程序降温并过夜，使用的程序降温盒的降温速度应≤1℃；

g、液氮存储：冻存盒提前预冻，将冻存管取出放置预冻冻存盒中，再放置到-196℃液氮中进行保存。

优选地，所述的角膜透镜保存液，由硫酸软骨素钠、透明质酸钠、右旋糖酐，右旋糖酐，甘油，丙酮酸钠，硫酸庆大霉素，碳酸氢钠，4-羟乙基哌嗪乙磺酸和注射用水配置而成，并调整ph值为7.1～7.6，各组分的含量为：硫酸软骨素钠10～30g/l、透明质酸钠0.1～5g/l、右旋糖酐400.5～15g/l，右旋糖酐700.1～10g/l，甘油5～25g/l，丙酮酸钠0.001～0.3g/l，硫酸庆大霉素0.001-0.05g/l，碳酸氢钠1～3g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5～7g/l。

优选地，所述的角膜透镜保存液的制备方法，包括如下步骤：

1)称量：按照以上配方分别称取原料；

2)配制：第一批投料：罐体预先加入总配制量40～45v/v％注射用水，控制水温≤65℃，分别投入硫酸软骨素钠、透明质酸钠、右旋糖酐40、右旋糖酐70、丙酮酸钠、碳酸氢钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸原料，补注射用水至总配制量的50～65v/v％，并搅拌30-120min；

3)第二批投料：控制水温≤40℃，投入硫酸庆大霉素，补注射用水至总配制量的66～70v/v％，并搅拌5-30min；

4)第三批投料：控制水温≤40℃，投入甘油，加入剩余注射用水定容并搅拌10-30min。

5)中间品检测：用盐酸和或氢氧化钠溶液调整ph值为7.1-7.6，取样进行外观检测；

6)除菌过滤；

7)灌封。

优选地，步骤5)外观检测的指标为无色至微黄色澄明液体、无悬浮物、无沉淀。

优选地，步骤6)除菌过滤中，先经过预过滤器进行预过滤，再通过0.2μmpes过滤器进行除菌过滤。

优选地，步骤7)灌封，采用低硼硅安瓿瓶或中硼硅安瓿瓶灌装，经加塞和轧盖而成。

有益效果：

1、本发明针对角膜透镜采用液氮超低温保存工艺，可将smile手术收集的角膜透镜进行长达数年的保存，保存的角膜透镜与新鲜角膜透镜相比，能够极大程度维护维持角膜透镜的完整性，并且降低抗原性。

2、本发明首次采用硫酸软骨素钠协同透明质酸钠、右旋糖酐40和右旋糖酐70的复配体系(即：硫酸软骨素钠&透明质酸钠&右旋糖酐)，能够形成胶体体系，抑制角膜透镜的溶胀，保护胶原纤维结构不被破坏，最大限度的保存角膜透镜，能够长期维持角膜组织原有的胶原纤维结构和透明性，利用此保存液保存角膜透镜时，角膜各层均可吸收小分子量硫酸软骨素，从而使水流入基质导致角膜水肿，而右旋糖酐的加入则克服了上述缺点，有助于减少基质层中蛋白多糖的丢失，从而维持角膜透镜组织的透明性。

说明书附图

图1为新鲜，超低温保存1年、2年、2.5年的角膜透镜外观图；a为新鲜角膜透镜外观图，b为超低温保存1年角膜透镜外观图；c为超低温保存2年角膜透镜外观图；d为超低温保存2.5年角膜透镜外观图；

图2为新鲜，超低温保存1年、2年、2.5年的角膜透镜组织切片显微镜电镜图；a为新鲜角膜透镜组织切片显微镜电镜图，b为超低温保存1年角膜透镜组织切片显微镜电镜图；c为超低温保存2年角膜透镜组织切片显微镜电镜图；d为超低温保存2.5年角膜透镜组织切片显微镜电镜图；

图3为新鲜，超低温保存1年、2年、2.5年的角膜透镜组织切片透射电镜图；a为新鲜角膜透镜组织切片透射电镜图，b为超低温保存1年角膜透镜组织切片透射电镜图；c为超低温保存2年角膜透镜组织切片透射电镜图；d为超低温保存2.5年角膜透镜组织切片透射电镜图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例1：

将眼科医院smile手术后的角膜透镜收集至无菌角膜透镜专用保存液中密封并浸泡60min后，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷，在超净工作台中进行以下操作：外观合格后使用专用的无菌转移环将取出角膜透镜，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间10min；再将其转移至2ml含无菌角膜透镜专用保存液冻存管中，旋紧外盖，并进行标记；倒置冻存管并来回翻转，确保内溶液不能外漏；放置到程序降温盒(程序降温盒的降温速度≤1℃)中再转至-70℃～-80℃深低温冰箱过夜，取出放置到液氮(-196℃)中进行长期保存。

其中角膜透镜专用保存液的各组分的含量为：

注射用水1l，硫酸软骨素钠20g/l、透明质酸钠1g/l、右旋糖酐402g/l，右旋糖酐708g/l，甘油10g/l，丙酮酸钠0.005g/l，硫酸庆大霉素0.005g/l，碳酸氢钠2g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.1g/l，，ph值为7.1～7.6。

上述角膜透镜专用保存液的制备方法为：

按照以上配方分别称取原料，加入总注射用水的45v/v％，控制水温60±1℃，分别投入硫酸软骨素钠、透明质酸钠、右旋糖酐40、右旋糖酐70、丙酮酸钠、碳酸氢钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸原料，补液至总注射用水的65v/v％，并搅拌50min；控制水温39±1℃，投入硫酸庆大霉素，补液至总注射用水的70v/v％并搅拌15min；控制水温39±1℃，投入甘油，加入剩余量的注射用水定容并搅拌25min，用盐酸和或氢氧化钠溶液调整ph值为7.1-7.6后进行除菌过滤和灌装。

实施例2：

将眼科医院smile手术后的角膜透镜收集至无菌角膜透镜专用保存液中密封并浸泡120min后，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。在超净工作台中进行以下操作：外观合格后使用专用的无菌转移环将取出角膜透镜，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间5min；再将其转移至2ml含无菌专用角膜透镜保存液冻存管中，旋紧外盖，并进行标记；倒置冻存管并来回翻转，确保内溶液不能外漏；放置到程序降温盒(程序降温盒的降温速度≤1℃)中再转至-70℃～-80℃深低温冰箱过夜，取出放置到液氮(-196℃)中进行长期保存。

上述的无菌专用角膜透镜保存液各组分的含量为：

注射用水1l，硫酸软骨素钠15g/l、透明质酸钠2g/l、右旋糖酐405g/l，右旋糖酐708g/l，甘油15g/l，丙酮酸钠0.01g/l，硫酸庆大霉素0.007g/l，碳酸氢钠1.8g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.6g/l，ph值为7.1～7.6。

上述角膜透镜专用保存液的制备方法为：

按照以上配方分别称取原料，加入加入总注射用水的45v/v％，控制水温55±1℃，分别投入硫酸软骨素钠、透明质酸钠、右旋糖酐40、右旋糖酐70、丙酮酸钠、碳酸氢钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸原料，补液至总注射用水的60v/v％，并搅拌50min；控制水温30±1℃，投入硫酸庆大霉素，补液至总注射用水的68v/v％，并搅拌15min；控制水温30±1℃，投入甘油，加入剩余量的注射用水定容并搅拌25min，用盐酸和或氢氧化钠溶液调整ph值为7.1-7.6后进行除菌过滤和灌装。

将上述实施例分别在1年、2年、2.5年时间点取出液氮中保存的角膜透镜，立即放入37℃±2℃温度的恒温水浴锅中快速融化复温10～30min，然后再用0.9％无菌生理盐水冲洗10～30min后直接迅速开展外观拍照，再将其分别浸泡在4％多聚甲醛、2.5％戊二醛中进行超微结构观察，结果如下：

(1)外观检测：将本品置于自然光或日光灯下，目力观察其外观。结果见图1。

经试验，采用超低温长期保存角膜透镜1年、2年、2.5年，角膜透镜外观均为中央平整、光滑、透明、无水肿和浑浊现象，与新鲜角膜透镜外观无差异。

(2)超微结构-组织切片观察：结果见图2。

显微镜下观察，采用超低温长期保存角膜透镜1年、2年、2.5年，角膜透镜无增厚和水肿，并且胶原纤维排列整齐、紧密，与新鲜角膜透镜外观无显著差异。

(3)超微结构-透射电镜观察，结果见图3。

透射电镜下观察，采用超低温长期保存角膜透镜1年、2年、2.5年，角膜透镜胶原纤维无显著变化，胶原纤维完整，并且排列均匀、规则、无明显分离。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。