一种环保型复合防霉防腐剂及其应用的制作方法

本发明涉及海洋生物防霉防腐技术领域，具体涉及一种环保型复合防霉防腐剂及其应用。

背景技术：

海洋生物种类繁多，不同类型的生物标本制作和保藏的方法也不尽相同。随着海洋生物研究的进一步深入，海洋生物标本的收集和保存显得意义重大，同时海洋生物标本作为生物学科的重要素材，是教学的重要模型，也是科学传播的重要载体。因此，将海洋生物制作成标本具有重要的教学和科研意义。

标本易因霉菌的危害而受损，导致使用寿命缩短，从而造成经济损失，因此防霉防腐是标本保存的关键一环，直接决定标本的保存寿命。标本霉菌主要包括烟曲霉、棒曲霉、黑曲霉等22个菌株，目前的标本消杀霉菌方法主要为化学药品法，而大多防腐配方中含有毒化学品，易对工作人员及参观者的身体健康造成伤害，并且现存方法难以实现完全控制标本霉菌的效果。福尔马林，即甲醛水溶液，是目前使用较多的标本保存液，其防腐效果好、渗透能力强，可与标本蛋白质中的官能团结合，使蛋白质凝固，杀菌的同时又可保持标本的组织形态，具有良好的固定作用。但甲醛是高毒化学品，挥发性极强，可对人的多种器官造成损害，会强烈刺激眼睛、皮肤、呼吸道黏膜等，最终造成免疫功能异常、肝损伤及神经中枢系统受到影响，将导致胎儿畸形、白血病、慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、女性月经紊乱、急性精神抑郁症等疾病。基于甲醛的高毒属性，早于2004年6月，世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)的153号公告将甲醛由2类致癌物质上升为1类致癌物质。此外，福尔马林长期保存的标本，会发生硬化、黄变现象，且有白色沉淀物和浑浊现象；保存液也易因甲醛的挥发，浓度降低，逐步失去保存标本的功能，需要定期补充或更换。

因此研制一种安全无毒、无二次污染，安全环保的标本防霉防腐剂迫在眉睫。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种环境友好型的复合防霉防腐制剂，该防腐制剂通过以壳聚糖、壳聚糖季铵盐，纳米银，苯甲酸钠，凯松为主要组份制备合成一种新型抑霉防腐材料，应用于标本的保存处理，高效、环保，具有很好的推广应用价值。

壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基团后的一种衍生物，是一种天然的d型氨基葡萄糖聚合物。壳聚糖不溶于水，能溶于醋酸、甲酸等有机溶剂，且粘度较高。将壳聚糖进行化学修饰得到的功能性衍生物，其溶解度可大大提高。壳聚糖具有广泛抗微生物活性已有验证，能够广泛抑制和消灭真菌、海藻和部分细菌。壳聚糖对于不同的微生物的抑制作用的机理也不同：(1)对于革兰氏阴性菌g-(大肠杆菌e.coli)，主要是由于小分子的壳聚糖渗透进入到微生物细胞内，吸附细胞内带负电的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌；(2)而对于革兰氏阳性菌g+(金黄色葡萄球菌)，主要是由于大分子的壳聚糖吸附在微生物细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内运输，从而起到杀菌和抑菌作用。

银离子及其盐类的抑菌性能早已被认可，纳米银就是将粒径做到纳米级的粉末状银单质，粒径小于100nm，一般在25-50nm之间，纳米银颗粒直接进入菌体与氧代谢酶(-sh)结合，阻断呼吸代谢使菌体窒息而死的独特作用机制，可杀死与其接触的大多数细菌、真菌、霉菌、孢子等微生物。经实验，对各类革兰氏阴氏菌、革兰氏阳氏菌、真菌、淋球菌、沙眼衣原体等650多种菌在数分钟内杀死，广谱杀菌且无任何的耐药性。纳米银的性能与其粒径有直接关系，粒径越小，价态越高，杀菌性能越强，10nm大小的纳米银颗粒可迅速直接杀死细菌，使其丧失繁殖能力。纳米银颗粒具有超强的渗透性，可迅速渗入皮下2nm杀菌，对普通细菌、顽固细菌、耐药细菌以及真菌引起的较深处的组织感染均有良好的永久性杀菌作用，且纳米银无毒、无味，无污染、无皮肤刺激性，无致癌性，不伤害人体。

苯甲酸钠(sodiumbenzoic)是一种白色颗粒或晶体粉末，无臭或微带安息香气味，味微甜，有收敛味。也称安息香酸钠，相对分子质量144.12。在空气中稳定，易溶于水，其水溶液的ph值为8，溶于乙醇。苯甲酸及其盐类是广谱抗微生物试剂，但它的抗菌有效性依赖于食品的ph值。随着介质酸度的增高其杀菌、抑菌效力增强，在碱性介质中则失去杀菌、抑菌作用。其防腐的最适ph值为2.5-4.0。

凯松是国际上公认的安全、高效、广谱性日化品限用防腐剂，其活性份为异噻唑啉酮类化合物，由于其毒性低、抗菌作用范围广、效果强、配伍性能好，且能溶解于水，不含任何重金属，能有效的抑制和灭除菌类和各种微生物。

本发明提供的环保型复合防霉防腐剂创新性地将壳聚糖、壳聚糖季铵盐、纳米银、苯甲酸钠、凯松等广谱有效抑菌成分组合起来，制备具强烈抗菌、抑霉防腐的环保型海洋生物浸制标本的保存液，实现对传统的福尔马林(甲醛溶液)保存液的理想替代。

为达到上述目的，本发明第一方面提供一种环保型复合防霉防腐剂，主要由以下浓度含量的组分组成：壳聚糖100-10000ppm、壳聚糖季铵盐100-10000ppm、纳米银100-10000ppm、苯甲酸钠100-10000ppm、凯松100-10000ppm、余量为水。

本发明第二方面提供一种环保型复合防霉防腐剂的制备方法，包括以下步骤：按照所述环保型复合防霉防腐剂的组成称取各组分，搅拌混合均匀制备所得。

本发明第三方面提供一种生物标本的制备方法，包括以下步骤：

1)将待浸制的生物样品浸泡于40-50％乙醇1-3天；

2)将步骤1)所得浸泡于75-85％乙醇1-4天，取出晾干；

3)将步骤2)所得样品浸泡于无水乙醇1-2天；

4)将步骤3)所得样品浸泡于100-10000ppm双乙酸钠液体10-20天；

5)将步骤4)所得样品取出，浸泡于75-85％乙醇1-2天；

6)将步骤5)所得样品浸泡于本发明第一方面所述的环保型复合防霉防腐剂中，即可得生物标本。

在本发明一实施例中，所述步骤1)中，所述待浸制的生物样品为鱼、虾、蟹或贝。

进一步优选地，所述待浸制的生物样品为贝，所述贝为敞口的贝类。

在本发明一实施例中，所述生物标本的制备方法的步骤1)，待浸制的生物样品浸泡于45％乙醇2天。

在本发明一实施例中，所述生物标本的制备方法的步骤2)，将步骤1)所得样品浸泡于80％乙醇1-2天，取出晾干。

进一步优选地，所述步骤1)中所述待浸制的生物样品为虾、蟹或贝，则所述步骤2中将步骤1)所得样品浸泡于80％乙醇1天。

进一步优选地，所述步骤1)中所述待浸制的生物样品为鱼，则所述步骤2中将步骤1)所得样品浸泡于80％乙醇2天.

在本发明一实施例中，所述生物标本的制备方法的步骤3)，将步骤2)所得样品浸泡于无水乙醇1天。

在本发明一实施例中，所述生物标本的制备方法的步骤4)，将步骤3)所得样品浸泡于100ppm双乙酸钠液体15天。

在本发明一实施例中，所述生物标本的制备方法的步骤5)，将步骤4)所得样品取出，浸泡于80％乙醇1天。

进一步优选地，所述步骤1)中所述待浸制的生物样品为虾、蟹或贝，则步骤5)中，虾、蟹和贝需要沥干后再浸泡于标本保存液中。

进一步优选地，所述步骤1)中所述待浸制的生物样品为鱼，则步骤5)中，鱼类不沥干即可浸泡于标本保存液中。

本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的环保型复合防霉防腐剂、如本发明第二方面所述的环保型复合防霉防腐剂的制备方法或如本发明第三方面所述的生物标本的制备方法在生物标本防霉防腐中的应用，其中，所述生物标本防霉防腐中的应用包括对脊椎动物、哺乳动物和软体动物标本，皮张及组织进行长期防霉防腐保存处理。

进一步地，所述生物标本防霉防腐中的应用包括对鱼、虾、蟹或贝进行长期防霉防腐保存处理。

在本发明一实施例中，所述生物标本防霉防腐中的应用包括：长期防霉防腐保存处理过程中，定期置换浸泡液。

在本发明一实施例中，所述的环保型防霉防腐剂在生物标本防霉防腐中的应用以涂抹、浸泡或者喷淋标本，起到标本防霉防腐作用。

本发明有益效果如下：

1、本发明以壳聚糖、壳聚糖季铵盐、纳米银、苯甲酸钠、凯松等广谱有效抑菌成分组合起来，制备环保型海洋生物浸制标本的复合防霉防腐制剂，其配方合理、成分科学安全、环境友好，无二次污染，是一种具有芳香气味的环保型防腐制剂；

2、本发明提供的环保型复合防霉防腐剂有较强抑菌抗霉效果，其对动物标本的组织器官无任何破坏、发暗、变色作用，保持自然状态，可以长久保存，对保护标本，减少因标本霉变带来的经济损失，以及保护人类健康具有重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明实施例提供的海洋生物标本的标本外观图；

图2为本发明实施例提供的海洋生物标本的肌肉形态观察图；

图3为本发明实施例提供的海洋生物标本中3号贝类的电子显微镜观察图；

图4为本发明实施例提供的海洋生物标本中虾的电子显微镜观察图；

图5为本发明实施例提供的海洋生物标本中蟹的电子显微镜观察图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例1：环保型复合防霉防腐剂的制备

本发明提供环保型复合防霉防腐剂主要由以下浓度含量的组分组成：壳聚糖100-10000ppm、壳聚糖季铵盐100-10000ppm、纳米银100-10000ppm、苯甲酸钠100-10000ppm、凯松100-10000ppm、余量为水。

根据上述组分配制，即可得环保型复合防霉防腐剂。

实施例2：环保型复合防霉防腐剂的抗霉变效果检测

1)选测菌种：黑曲霉菌、米曲霉菌、木霉菌、青霉菌、白曲霉菌、黄曲霉菌(均为生物标本上分离到的霉菌)；

2)检测方法：平板抑菌圈法(采用营养琼脂平板)；

3)检测温度：26℃±2℃；

4)检测时间：72小时；

5)检测结果：本发明防腐制剂对所选菌种均有明显的抑制效果，抑菌圈直径如下：白曲霉菌160mm、黑曲霉菌130mm、黄曲霉136mm、青霉菌130mm、木霉菌113mm、米曲霉菌142mm。

实施例3：环保型复合防霉防腐剂的抑菌效果检测

1)选测菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌等(皆为实验室常规菌种)；

2)检测方法：平板抑菌圈法(采用营养琼脂平板)；

3)检测温度：35℃±1℃；

4)检测时间：24小时；

5)检测结果：用卡尺测量。实验结果显示本发明防腐制剂对所选菌种均有明显的抑制效果，抑菌圈直径介于20-35mm之间。

实施例4：环保型复合防霉防腐剂对海洋生物标本的保存效果检测

1实验材料：鱼、虾、蟹和贝购自湛江东风市场；本发明实施例1制备的环保型复合防霉防腐剂；10％甲醛保存液，广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产；无水乙醇，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；2.5％戊二醛em电镜固定液：50ml0.2mpbs(ph7.2)与10ml25％戊二醛混合后用双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。

2实验方法：

2.1样品浸泡处理

将鱼、虾、蟹和贝等样品平分两份，一份为实验组，一份为对照组。先用钩子取出鱼类的内脏，洗刷干净甲壳类动物表面，放入透明塑料箱中。

生物标本的制备方法，按下述步骤进行：

1)将待浸制的生物样品浸泡于45％乙醇2天；

2)将步骤1)所得浸泡于80％乙醇1-2天，取出晾干；

3)将步骤2)所得样品浸泡于无水乙醇1天；

4)将步骤3)所得样品浸泡于100ppm双乙酸钠液体15天；

5)将步骤4)所得样品取出，浸泡于80％乙醇1天；

6)将步骤5)所得样品浸泡于标本保存液中，即可得生物标本。

其中，步骤2)中虾、蟹和贝的浸泡时间为1天，鱼的浸泡时间为2天；步骤5)中虾、蟹和贝需要沥干后再浸泡于标本保存液中，而鱼类则不需要沥干即可浸泡于标本保存液中。步骤6)中实验组采用本发明实施例1提供的环保型复合防霉防腐剂作为保存液，对照组采用10％甲醛作为保存液。

生物标本制备完成后，密封保存，3个月、6个月后定期取标本样品观察。

2.2取样方法

5ml离心管、镊子、手术剪高压灭菌后，取75％酒精备用。甲壳类动物，贝类打开壳，取贝肉的肌肉组织；蟹、虾剥壳取肌肉部分；鱼类取背鳍左右部分的肌肉组织。实验组与对照组平行取样，一个样品取样2次，每管3-4个1立方毫米大小的肌肉组织，置于5ml离心管中，加em电镜固定液至管口约1-2cm处，盖紧离心管盖，用封口膜将盖子与管身接口处进行密封，置于泡沫箱中，快递至中山大学生命科学院电镜室。

观察长时间浸泡后实验组与对照组对样品的肌肉组织伤害差别及各自的保存效果。

2.3实验结果：

1)标本外观观察

实验组浸泡的标本色彩保留度高，可清晰辨认，与原样品相似度高，骨骼僵硬，与刚放入保存液时的状态一致；而对照组标本表面表皮掉落，有明显褪色现象，有较大的刺鼻气味，骨骼软化，整体较软，无其他变化，结果详见图1。

2)标本肌肉形态观察

实验组标本，存在一定程度的脱水现象，甲壳类标本肌肉组织溶解程度较高，甚至会出现肌肉组织自溶的现象，变成黄色粘稠液体流出。贝类容易在浸泡时自动开壳，未开壳的贝类后期也容易打开，肉质较软但颜色偏黄，得率低；对照组贝类肉质偏硬，不易开壳，但整体完整性较好，较好的保存了里面的肌肉组织，结果详见图2。

3)电镜结果分析

在本发明一实施例中，本发明实施例提供的环保型复合防霉防腐剂对贝类标本的保存效果电镜检测结果表明：实验组的保存液对敞口的贝类的保存效果更好。样本处理方式如无特殊说明，均参照上述实施例4的步骤：取贝类分三组分别编号：1号贝类直接带壳浸泡，浸泡过程中出现开口情况最少；2号贝类直接带壳浸泡，浸泡过程未出现开口但是取样时较易开壳；3号贝类敞口直接裸露浸泡在两种保存液中。

综合三种贝类的电镜图片分析，3号贝类的电镜图片内容较为丰富即可认为其各组织状况较为另外二种贝类要好一些。同时在贝类取样时，1号贝类和2号贝类浸泡在实验组的样品，较之浸泡在甲醛对照组的中的样品，其肌肉部分明显有脱水缩小发黄的迹象，而3号贝类在甲醛浸泡和标本保存液浸泡中无较大差异。因此可认为，实验组的保存液对敞口的贝类的保存效果更好。

电子显微镜结果如图3所示，该部位应为3号贝类肌纤维(平滑肌)，实验组标本组织更密集，核糖体数量较多，细胞排列较紧密，但是出现部分溶解，未见明显细胞器；对照组断裂部分多，肌纤维断裂痕迹有长有短，细胞凋亡程度更剧烈，可见高尔基体。

在本发明一实施例中，参照上述实施例4的步骤，本发明实施例提供的环保型复合防霉防腐剂对虾标本的保存效果电镜检测结果(如图4)表明：实验组肌纤维形状不明显，部分肌节短缩，轮廓较模糊和松散，可见线粒体；对照组肌纤维溶解程度较大，z线断裂、嵴断裂，可见脂滴聚集，然骨骼肌形状较清晰。

在本发明一实施例中，参照上述实施例4的步骤，本发明实施例提供的环保型复合防霉防腐剂对蟹标本的保存效果电镜检测结果(如图5)表明：实验组标本组织纤维有序列，没有破坏，更密集，核糖体数量较多，细胞排列紧密；而对照组标本组织纤维破坏严重，完全无有序，断裂部分多，肌纤维断裂痕迹有长有短，细胞凋亡程度更剧烈。

综上，针对电镜扫描的结果，对照组(甲醛保存液)更多的破坏肌纤维肌节之间的连接，同时产生大量空泡变性，肿胀，使肌纤维断裂、扭曲、分节，从而导致肌纤维失去弹性，造成样品肌肉组织紊乱。但是对于细胞器，会导致线粒体的较少和缺失，及线粒脊断裂，对细胞产生一定的损害，而溶酶体、内质网等低级细胞器，影响相对不如实验组。尽管肌肉组织得到了相对好的保留，但是原本肌肉组织均匀的排列分布都被破坏，长期下去必然会对样品产生多种不可逆且潜在的消极作用，不利于样品的长期保存，不符合标本的绿色环保可持续观念。

实验组(标本保存液)更多的是使细胞结构溶解及肌纤维自溶，从而在整体上看，产生均匀的颜色深浅变化，也就直接反应在肌肉组织的缩小。但是实验组的样品在电镜扫描中，表现了良好的整体完整性，在这个过程中，一定程度上使标本的整体的肌肉组织产生变化，但可认为长期浸泡不会对标本肌肉组织或细胞结构产生额外不良的蓄积反应，如空泡变性、线粒体堆积等。

结合外观图片分析，实验组整体上效果优于对照组。其无味无色，极大减少了挥发性气味对人体的损害及本身颜色对浸泡标本样品带来的影响。

综上所述，通过从标本外观观察、标本肌肉形态观察以及电子显微镜观察等结果分析，本发明提供的环保型复合防霉防腐剂(实验组)对浸泡标本的整体保存效果要优于传统的福尔马林保存液(对照组)，同时无味无色低毒，极大减少了挥发性气味对人体的损害及本身颜色对浸泡标本样品带来的影响，虽然其成分可能会造成样品一定程度脱水，导致长期保存中防腐效果略微逊色于福尔马林保存液，但规律性的置换浸泡液可以解决这个问题。该复合防霉防腐剂成分环保绿色，无味无色低毒，有效减少挥发性气味对人体的损害，对人体和环境危害很小，同时制作容易，方法简便，对标本具有良好的保存、固定、杀菌、防霉防腐作用，具有极大的推广价值，是福尔马林保存液的理想替代产品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。