一种确定浓香型香水莲花最佳采收期的方法与流程

本发明涉及观赏植物种植技术领域，尤其涉及一种确定浓香型香水莲花最佳采收期的方法。

背景技术：

香水莲花(nymphaeahybrid)，花色丰富，有黄、紫、蓝、红、白等九大色系；不同花色香水莲花香味不同，由清香转至浓郁芳香，故人们又称香水莲花为“九品香莲”。在适宜温度下，香水莲花可终年开花，不仅可作为优质的高档鲜切花及重要的观赏水生花卉，用作盆栽或园林造景等；因其体内富含黄酮、多糖及多酚类物质，在医药、食品、香水、化妆品等领域也具有极大的实用价值，是天然香精香料植物。香水莲花，作为一种多功能芳香水生花卉，发展潜力巨大。

目前，在花茶制作和精油提取等领域主要选择的是浓香型香水莲花，尤其以‘黄花型’香水莲花最受欢迎，主要使用的部位是香水莲花的花朵；而对香水莲花的花朵进行采摘时，由于不能确定其最佳的采收期，人们往往是见花就摘，因此，收获的香水莲花品质参差不齐，加工得到的产品，如花茶或精油的质量没有统一的标准，不仅浪费了原材料，且产品的质量受到很大的影响。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种简单、快捷的确定浓香型香水莲花最佳采收期的方法。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种确定浓香型香水莲花最佳采收期的方法，包括以下步骤：

1)观察浓香型香水莲花开花物候期，将花期划分四个时期，花蕾期s1、初花期s2、盛花期s3和末花期s4；

2)在自然光照下，盛花期的浓香型香水莲花的花瓣完全展开，萼片和第一轮花瓣呈160°～180°开展，雄蕊全部可见，且花瓣和雄蕊均呈金黄色，确定所述香水莲花处于最佳采收期。

进一步地，所述浓香型香水莲花为‘黄花型’香水莲花。

进一步地，步骤1)中所述花期划分标准为：花蕾期s1，花瓣完全被萼片包裹，花蕾紧实；初花期s2，花朵半开，仅看到部分花瓣，花萼朝上未展开；盛花期s3，花朵完全开放，花瓣和雄蕊金黄完全可见，花萼向四周开展；末花期s4，花朵收缩即将凋谢，雄蕊发黑。

进一步地，还包括确定浓香型香水莲花最佳采收期的5项辅助检测手段，分别为：3.1)测定香水莲花的花色指标、3.2)测定香水莲花的生长指标、3.3)测定香水莲花的花香物质成分、3.4)测定香水莲花开花期的保护酶活性和3.5)观察香水莲花香气物质分泌的显微结构，当上述5项辅助检测手段同时达标，则步骤2)确定的最佳采收期判定结果更精确。

进一步地，所述5项辅助检测手段确定浓香型香水莲花处于最佳采收期的标准分别为：

3.1)测定香水莲花的花色指标：所述最佳采收期的香水莲花色相b*≥50.86，彩度c*≥50.87；

3.2)测定香水莲花的生长指标：所述最佳采收期的香水莲花花朵的花径不低于18.58cm、鲜重不低于22.05g、干重不低于2.58g；

3.3)测定香水莲花的花香物质成分：所述最佳采收期的香水莲花的挥发性香气物质种类不低于61种，挥发性香气物质的总相对含量不低于99.20％，赋香物质苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯基甲基酯的相对含量分别不低于5.78％、23.43％和12.15％；

3.4)测定香水莲花开花期的保护酶活性：所述最佳采收期的香水莲花的保护酶活性pod活性不低于146.50u/g·min、sod活性不低于220.03u/g·min、cat活性不低于12.10mg/g·min；

3.5)观察香水莲花香气物质分泌的显微结构：所述最佳采收期的香水莲花的花瓣细胞内质体直径不小于1.8μm，嗜锇酸基质颗粒形态圆润且界面清晰。

本发明具有以下有益效果：本发明通过花期判断及盛花期香水莲花的花瓣和雄蕊颜色、花瓣展开程度及萼片和第一轮花瓣的展开程度的形态观测可确定浓香型香水莲花的最佳采收期，简单方便，在上述形态观测基础上结合5项辅助检测手段可更精确地确定浓香型香水莲花的最佳采收期，结果更可靠，有效确定浓香型香水莲花的最佳采收时期，可为香水莲花花茶的制作、芳香精油的提取提供技术支撑，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明的香水莲花不同时期花型示意图，其中，s1为花蕾期，s2为初花期，s3为盛花期，s4为末花期；

图2为本发明实施例的花蕾期s1香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

图3为本发明实施例的初花期s2香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

图4为本发明实施例的盛花期s3香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

图5为本发明实施例的末花期s4香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

图6为本发明实施例的不同花期香水莲花保护酶活性测定结果，其中，a为不同花期香水莲花的过氧化物酶(pod)活性测定结果，b为不同花期香水莲花的超氧化物歧化酶(sod)活性测定结果，c为不同花期香水莲花的过氧化氢酶(cat)活性测定结果，其中，s1为花蕾期，s2为初花期，s3为盛花期，s4为末花期；

图7为本发明实施例的不同花期香水莲花花瓣透射电镜图，其中，s1为花蕾期，s2为初花期，s3为盛花期，s4为末花期，v-液泡，cw-细胞壁，p-质体，s-淀粉粒，mg-嗜锇酸基质颗粒。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例

一、仪器与材料

仪器：色差仪(3nh分光测色仪ys3010，深圳三恩时科技有限公司)；梅特勒pl602-s电子天平(mettlertoledo，sweden)；spme和聚二甲基硅氧烷纤维pdms/dvb-65μm(pdms/dvb)的手动spme不分流注射器(supelcoinc.,bellefonte,usa)；trace1300iso-ltgc1300气象色谱质谱联用仪(thermofisherscientific,usa)；lkbiii型超薄切片机(lkbproducter，sweden)；电子显微镜(hitachihu12a，japan)。

材料：香水莲花材料采自厦门香水莲花种植基地的‘黄花型’香水莲花；香水莲花的栽植条件一致，均种植于同一规格的种植池(长×宽×深：10m×20m×0.5m)中，用相同的栽培条件(包括土壤、施肥、水质及病虫害防治等措施)，株行距为2×2m；

材料采摘时间：于晴天上午8：00，温度为26℃左右，露水刚干时，采集不同开花期的香水莲花花朵，鲜花采集后随机分为两个部分，一部分进行形态观测和生物量、花香的测定；另一部分液氮保存，置于实验室-80℃冰箱保存备用，用以测定生理指标。

二、确定浓香型香水莲花最佳采收期的方法，包括以下步骤：

1)香水莲花不同花期划分与最佳采收期判定

观察‘黄花型’香水莲花开花物候期，将花期划分四个时期，即花蕾期s1、初花期s2、盛花期s3和末花期s4，花期划分标准为：花蕾期s1，花瓣完全被萼片包裹，花蕾紧实，如图1(s1)所示；初花期s2，花朵半开，仅看到部分花瓣，花萼朝上未展开，如图1(s2)所示；盛花期s3，花朵完全开放，花瓣和雄蕊金黄完全可见，花萼向四周开展，如图1(s3)所示；末花期s4，花朵收缩即将凋谢，雄蕊发黑，如图1(s4)所示；

从图1可知，在自然光照下，盛花期s3的浓香型香水莲花，花瓣完全展开，萼片和第一轮花瓣呈160°～180°开展，雄蕊全部可见，且花瓣和雄蕊均呈金黄色，由此判定所述香水莲花处于最佳采收期。

2)确定不同花期香水莲花的花色指标

使用国际照明委员会(cie)制定的cie-1976-l*a*b*表色系统实现花色的数字化测定，即使用色差仪(3nh分光测色仪ys3010，深圳三恩时科技有限公司)测定花色的色相a*、b*值，并计算彩度c*，c*＝(a*²+b*²)^1/2；每朵花的测定位置为花瓣上表皮的中间部分，每朵花测五个花瓣，每个花期测五朵花，取平均值；结果见表1。

表1‘黄花型’香水莲花开花过程花色变化

对于‘黄花型’香水莲花，色相b*和彩度c*这两个指标能够体现出‘黄花型’香水莲花金黄的花瓣颜色特征。从表1可知，浓香型香水莲花色相b*和彩度c*随花期(花蕾期s1、初花期s2、盛花期s3和末花期s4)先增后降，在盛花期s3的花瓣色相b*和彩度c*达到最大值，分别为50.86、50.87，其中b*的正值和负值分别代表黄度和蓝度，b*越大，表示花色越黄，c*值越大，表示彩度越大。因此，当检测到盛花期s3的浓香型香水莲花的b*和c*值均不低于50.86和50.87时，则此时期浓香型香水莲花的花色达到最佳状态，更适宜采收。

3)确定不同花期香水莲花的生长指标

采集不同花期的浓香型香水莲花全花，测量花径；洗净擦干后称得鲜重；然后置于105℃烘箱中杀菌30分钟，在80℃下烘干至恒重，称得干重；结果见表2。

表2‘黄花型’香水莲花的生长指标

花径、鲜重和干重是香水莲花花朵生长发育的一个重要指标，能够表征香水莲花鲜花的品质。从表2所示的香水莲花的生长指标测定结果可见，香水莲花的花径、鲜重和干重随花期(花蕾期s1、初花期s2、盛花期s3和末花期s4)先增后降，在盛花期s3达到最大值，分别为18.58cm、22.05g、2.58g。因此，当检测到盛花期s3的浓香型香水莲花的花径、鲜重和干重均不低于18.58cm、22.05g、2.58g时，则此时期浓香型香水莲花的花型和物质积累程度最佳，更适宜采收。

4)测定不同花期香水莲花花香物质

采用spme和聚二甲基硅氧烷纤维pdms/dvb-65μm(pdms/dvb)的手动spme不分流注射器(supelcoinc.,bellefonte,usa)来吸附香水莲花的挥发性物质，不同花期香水莲花花香物质的具体测定步骤如下：

4.1)预处理：正式进样前，将萃取头在气相色谱仪的进样口中老化30min(250℃)，新的萃取头则需在250℃条件下老化2h；

4.2)试验处理：

4.2.1)将香水莲花花瓣样品暴露在带有塑料瓶盖的棕色玻璃瓶中的纤维头下，将注射器通过瓶盖上的隔膜推入样品上空，在45℃下吸附50min，其中，载气流量设置为0.9ml/min，不分流；

4.2.2)采用trace1300iso-ltgc1300气象色谱质谱联用仪(thermofisherscientific,usa)进行gc-ms分析；

色谱条件为：db-5(含有5％苯基甲基硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm，thermofisherscientific,usa)弹性石英纤维毛细管柱；进样方式：不分流；

程序升温：初始40℃，保持2min，以4℃/min升温至110℃，保持2min；3℃/min升温至150℃，保持2min，5℃/min升温至200℃，保持4min；柱流量：1ml/min；高纯氦气(he)载气；

质谱条件：离子源温度250℃；四极杆温度250℃；电离方式ei，电子能量70ev；接口温度250℃；全扫描模式，扫描范围m/z33-450；

4.3)数据处理与分析：根据离子流峰面积归一化法来计算各组分在总挥发物中的相对含量；对采集到的物质质谱图用xcalibur及nist2014进行分析，并将各主要峰的质谱数据与相关文献进行比对，来确定香水莲花花香物质的化学成分；结果见图2、表3。

表3香水莲花花瓣4个时期挥发性物质种类及含量

由图2～5和表3所示的香水莲花的花香物质成分测定结果可知，挥发性物质种类及总相对含量为盛花期s3＞初花期s2＞花蕾期s1＞末花期s4，盛花期s3挥发物质的种类和相对含量均较高，挥发性香气物质的种类达到61种，相对含量达到99.20％，说明盛花期s3是香水莲花挥发性物质释放量最多的时期；浓香型香水莲花的香味浓度主要由苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯基甲基酯、反式-α-香柑油烯和十五烷控制，使花瓣产生浓郁的香味，其中主要赋香物质苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯基甲基酯在盛花期s3相对含量显著高于其他时期，分别达到5.78％、23.43％、12.15％。因此，当检测到盛花期s3的浓香型香水莲花的挥发物质的种类和相对含量，以及苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯基甲基酯含量均不低于上述测定值，即香水莲花的挥发性香气物质种类不低于61种，挥发性香气物质的总相对含量不低于99.20％，主要赋香物质苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯基甲基酯的相对含量分别不低于5.78％、23.43％和12.15％，则此时期浓香型香水莲花的挥发性花香物质释放量最多，更适宜采收。

5)不同花期香水莲花保护酶活性测定

5.1)制备香水莲花酶提取液

5.1.1)用nah2po4·2h2o和na2hpo4·12h2o两种试剂配制ph为7.0、浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲液；

5.1.2)称取0.3g香水莲花花瓣置于干净的研钵中，分三次加入6ml0.1mol/l的磷酸缓冲液充分研磨；

5.1.3)将步骤5.1.2)研磨后获得的混合液倒入10ml离心管中，在4℃、10000r/min的条件下离心30min，上清液即为香水莲花花瓣的酶粗提液；

5.2)测定花瓣中pod、sod和cat活性

使用步骤5.1)制备的香水莲花酶提取液测定花瓣中过氧化物酶(pod)活性、超氧化物歧化酶(sod)活性和过氧化氢酶(cat)活性，具体测定方法为：

5.2.1)愈创木酚法测定过氧化物酶(pod)活性：在试管中加入3.8ml配制好的0.3％愈创木酚溶液，然后加入0.1ml3％过氧化氢溶液，再加入0.3ml香水莲花酶提取液，充分摇匀后用紫外分光光度计在470nm波长下测定吸光值，以不加0.3ml香水莲花酶提取液的溶液(以等量的3％过氧化氢溶液替代)为对照；从加入香水莲花酶提取液时开启秒表计时，每30s读数一次，共读3次，计算公式如下。

△a470-反应时间内470nm下吸光值的变化；w-香水莲花花瓣样品鲜重，g；t-反应时间，min；vt-香水莲花酶提取液总体积，ml；vs-吸光度测定时取用的香水莲花酶提取液体积，ml。

5.2.2)氮蓝四唑(nbt)光化还原法测定超氧化物歧化酶(sod)活性：

测定管：取刻度试管，按以下步骤加入试剂：ph7.8的磷酸缓冲液1.5ml，130mmol·l^-1的甲硫氨酸溶液0.3ml，750μmol·l^-1的氮蓝四唑溶液0.3ml，100μmol·l^-1的edta溶液0.3ml，20μmol·l^-1的核黄素溶液0.3ml，蒸馏水0.5ml，最后加入0.05ml香水莲花酶提取液；

对照管：用磷酸缓冲液代替香水莲花酶提取液，充分摇匀，制备4支对照管；

测定管和对照管处理：将其中两支对照管放于暗处，另外两支对照管与测定管一同放置于4000lux光照下反应1h后，用黑布遮光终止反应；以不照光的对照管作空白用ph7.8的磷酸缓冲液调零，在560nm波长下分别测定各管的吸光度，并计算sod酶的活性，以sod抑制nbt光还原50％为一个酶活性单位，计算公式如下；

式中：ack-光照对照管的光吸收值；ae-测定管的光吸收值；v-样液总体积，ml；w-香水莲花花瓣样品重量，g；vs-测定时取用样液体积，ml。

5.2.3)高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(cat)活性：在刻度试管中加入2.5ml香水莲花酶提取液，对照组加入2.5ml高温下失活的香水莲花酶提取液，再分别加入2.5ml0.1mmol/l的h2o2溶液，同时计时，置于30℃的恒温水浴中保温30min后，立刻加入2.5mll0％的h2s04溶液，然后用0.1mmol/l的kmno4标准液进行滴定，直至溶液出现粉红色(且在30min内不消失)为终点；cat活性用每克样品在1min内分解h2o2的毫克数来表示，计算公式如下；

式中：a为对照组kmno4滴定的体积，ml；b为酶反应后kmno4滴定的体积，ml；vt为香水莲花酶提取液总体积，ml；vs为反应时所用香水莲花酶提取液体积，ml；w为香水莲花花瓣样品鲜重，g；t为反应时间，min；1.7为1ml0.1mmol/l的kmno4，相当于1.7mgh2o2；结果见图3-图5。

从图6所示的不同花期香水莲花保护酶活性测定结果可知，香水莲花在开花过程中，花瓣中保护酶活性(pod、sod、cat)在四个花期(花蕾期s1、初花期s2、盛花期s3和末花期s4)均表现出先上升后下降的趋势，在盛花期s3达到峰值，其中，花瓣pod活性为146.50u/g·min，sod活性为220.03u/g·min，cat活性为12.10mg/g·min，酶活性与鲜花的保鲜密切相关，保护酶活性高可减缓鲜花在采摘、运输和保存过程中发生的氧化作用。因此，当检测到盛花期s3的浓香型香水莲花花瓣pod活性不低于146.50u/g·min，sod活性不低于220.03u/g·min，cat活性不低于12.10mg/g·min，则此时期浓香型香水莲花的保鲜效果更佳，更适宜采收。

6)不同花期香水莲花花香气物质分泌的显微结构观察

6.1)采集不同花期的‘黄花型’香水莲花，花瓣处理为1mm²大小，固定于0.2mol/l的ph＝7.0的磷酸盐缓冲液配制的2.5％的戊二醛中，减压抽真空，使样品下沉；

6.2)在4℃冰箱中固定48h后用0.2mol/l的磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入1％饿酸固定3h，pbs缓冲液清洗2次，ph＝7.0的重蒸水清洗4次，ph＝10.0的重蒸水冲洗2次，每次30min；

6.3)用冷丙酮梯度脱水，环氧丙烷过渡，epon812包埋，超薄切片机切片；

6.4)经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜下观察并拍照。

从图7所示的不同花期香水莲花香气物质分泌的显微结构拍照结果可知，香水莲花释放香气的过程中，花瓣的超微结构及细胞内含物发生了明显的变化，细胞内质体体积从花蕾期s1到末花期s4先增后降，在盛花期s3达到最大，直径达1.8μm；嗜锇酸基质颗粒从花蕾期s1到盛花期s3，形态逐渐圆润，且颗粒界面清晰，到末花期s4发生降解，这些内含物质与浓香型香水莲花的花香联系紧密；因此，当检测到盛花期s3的香水莲花细胞内质体直径不小于1.8μm，嗜锇酸基质颗粒形态圆润且界面清晰，则此时期浓香型香水莲花香气更佳，更适宜采收。

综上，浓香型香水莲花需要在适宜的采收期内，即盛花期s3收获花朵，过早采收，花色暗淡，花朵大小和物质积累不足，挥发性物质未达到最佳释放量，且保护酶活性不够活跃；而采收过晚，花朵逐渐衰败，品质下降。

本实施例所检测的‘黄花型’香水莲花的各项指标与其不同花期具有较大的关联性，以香水莲花开花过程中花型、花瓣及雄蕊颜色变化最为明显可辨；因此，以香水莲花花瓣完全展开，萼片和第一轮花瓣呈160°～180°开展，雄蕊全部可见，且花瓣和雄蕊均呈金黄色为香水莲花最佳采收期的判别依据，既能保障浓香型香水莲花的品质和产量，又简单便捷，易于掌握，在此基础上辅以上述5项指标(花色指标、生长指标、花香物质成分、保护酶活性、香气物质分泌的显微结构)检测，可更精确地确定浓香型香水莲花的最佳采收期，结果更可靠，浓香型香水莲花的最佳采收时期的准确判定，可为香水莲花花茶的制作、芳香精油的提取提供技术支撑，具有良好的应用价值。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。