一种花药培养与离体染色体加倍结合快速选育水稻新品系的方法与流程

本发明涉及一种花药培养与离体染色体加倍结合快速选育水稻新品系的方法，它是通过杂种植株花药培养获得愈伤组织，而后直接对愈伤组织进行染色体加倍，快速获得加倍单倍体，经过鉴定选择获得纯合水稻新品系的方法，属于现代农业的作物遗传育种技术领域。

背景技术：

单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。单倍体在遗传育种及基础遗传研究中具有重要作用。主要表现在：(1)缩短育种时间，提高选择效率；(2)突变体选育；(3)通过远缘杂种花药培养获得染色体异附加系和代换系；(4)用于基础遗传研究，如基因功能研究、构建遗传作图群体、基因组测序等；(5)作为遗传工程受体(李树贤，2008；盖钧镒，2006；谢从华和柳俊，2004)。尤其在“缩短育种时间，提高选择效率”方面表现突出，水稻、小麦、玉米、油菜、烟草等作物中均有很多经单倍体育种选育出的优良新品种，在生产上发挥着重要作用(张献龙和唐克轩，2004；张天真，2011)。获得单倍体的途径主要有：(1)单性生殖，即自发或诱导产生孤雌生殖、孤雄生殖、无配子生殖、半配生殖等；(2)染色体消除，如球茎大麦法、玉米法；(3)细胞和组织离体培养。其中细胞和组织离体培养是目前获得单倍体的主要途径，它又包括花药或花粉培养、未授粉子房或胚珠培养，前者由于单倍体细胞数量更多、取材方便而成为诱导单倍体的主要方法(孙其信，2016；席章营等，2014)。

目前，水稻单倍体育种的主要程序是先将两亲本杂交后获得f1，然后对f1植株进行花药培养，诱导产生单倍体植株，再对单倍体植株进行染色体加倍获得加倍单倍体(纯合二倍体)，再对加倍单倍体的性状加以系统鉴定，选育出符合育种目标的优良新品系(张天真，2011)。具体操作时，需先通过(1)杂种花药培养形成愈伤组织、(2)愈伤组织分化形成植株、(3)单倍体植株的鉴定、(4)对单倍体植株进行活体染色体加倍获得加倍单倍体、(5)加倍单倍体的选育等步骤。其中愈伤组织需要先分化形成植株后，而后再对鉴定确认的单倍体植株进行加倍，这要耗费很长的时间；此外，传统染色体加倍一般采用活体加倍的方法，存在效率低、容易形成嵌合体等缺点。本发明则通过对杂种植株进行花药培养获得愈伤组织，进而直接利用愈伤组织进行离体染色体加倍，愈伤组织分化获得植株后，经鉴定获得所需性状的纯合水稻新品系。本发明的主要创新之处在于：(1)通过花药培养获得愈伤组织后，直接对愈伤组织进行染色体加倍；(2)采用离体染色体加倍方法，加倍效率比传统活体染色体加倍大幅提高，且很少形成嵌合体。因此，能够更加高效快速地选育出符合育种目标的优良新品系。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种花药培养与离体染色体加倍结合快速选育水稻新品系的方法，解决了目前水稻单倍体育种耗时长、效率低的问题，为水稻遗传育种及基础遗传研究提供材料基础。

本发明的技术方案为：a.不同水稻品种间杂交获得杂种；b.杂种种植及花药培养取材；c.材料低温预处理；d.花药培养获得愈伤组织；e.愈伤组织离体染色体加倍；f.加倍后愈伤组织恢复培养；g.愈伤组织分化出苗；h.芽苗生根培养；i.试管苗移栽；j.倍性鉴定；k.综合性状鉴定。

本发明的具体过程为：

a.不同水稻品种间杂交获得杂种

选择两个具有不同优势性状的水稻品种或一个综合性状好但目标性状需要改造的水稻品种、另一个具有目标性状的水稻品种，将两个水稻品种进行有性杂交获得杂种f1。

b.杂种种植及花药培养取材

种植杂种f1，植株孕穗期，选取叶枕距5～15cm、颖壳上部浅绿色下部淡黄色、雄蕊长度接近颖壳长度1/2的稻穗，将稻穗连同外部叶鞘、叶片一起取材。可取稻穗不同部位的颖花，挑出花药，用1％i2-ki溶液染色制片观察，确保按上述外部形态标准所取稻穗的花粉大部分处于单核靠边期。

c.材料低温预处理

剪除稻穗上的叶片，保留最后三片叶的叶鞘，用经蒸馏水浸湿的纱布包裹后装入自封袋，封口置于冰箱4℃条件下预处理7～10d。

d.花药培养获得愈伤组织

在超净工作台上剥出低温预处理后的稻穗，经消毒处理后，挑取颖花中的花药接种至花药愈伤组织诱导培养基中，置于26～28℃、黑暗条件下培养，至愈伤组织形成。花药愈伤组织诱导培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

e.愈伤组织离体染色体加倍

将生长旺盛的愈伤组织转移至加倍培养基中，置于26～28℃恒温摇床中，100～110rpm振荡培养48～60h。加倍培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+colchicine300～500mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

f.加倍后愈伤组织恢复培养

将加倍处理后的愈伤组织用无菌水冲洗3～5次，接种至恢复培养基中，置于26～28℃、黑暗条件下恢复培养7～10d。恢复培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

g.愈伤组织分化出苗

将恢复培养后的愈伤组织转移至分化培养基中，置于25℃、黑暗条件下培养3～5d，再转为光照12～14h/d条件下培养，至分化出苗。分化培养基配方：ms+6-ba1.0mg/l～1.5mg/l+kt1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.2mg/l～0.3mg/l+sucrose3％+agar0.75％，ph6.0。

h.芽苗生根培养

待愈伤组织分化出的芽苗长至3～5cm时，将其转入生根培养基中，25℃光照条件下培养，芽苗生根形成完整的小植株。生根培养基配方：1/2ms+6-ba0.1mg/l～0.3mg/l+naa0.3mg/l～0.5mg/l+activatedcarbon0.02％+sucrose2％+agar0.75％，ph6.0。

i.试管苗移栽

待试管苗根数3～5条，根长2～3cm时，揭开培养瓶的封口膜，加入0.5～1cm深的无菌水，25℃炼苗2～3d；用清水洗净试管苗根部的琼脂后，移栽于水田或稻缽中，移栽后最初几天注意遮阳及防淹水过深。

j.倍性鉴定

从形态学及结实性上基本可确定材料倍性，与单倍体植株相比，加倍单倍体，即二倍体dh1，植株较高、茎秆粗壮、可正常结实；相反，单倍体植株矮小、茎秆纤细、长势弱、不结实。同时，可利用倍性检测仪或流式细胞仪检测细胞dna含量、通过根尖染色体制片观察染色体数目加以验证。

k.综合性状鉴定

观察鉴定通过上述倍性鉴定确认的二倍体植株dh1，或dh1单株收获种子种植形成的株系dh2的综合性状，筛选同时具有两个亲本优势性状的植株、或综合性状好且具有目标性状的植株，从而获得纯合水稻新品系。

附图说明

图1花药培养形成愈伤组织

图2愈伤组织离体染色体加倍

图3加倍后愈伤组织分化出苗

图4耐盐富硒红米新品系及其亲本的稻米

左：9311；中：耐盐富硒红米新品系；右：海稻86

具体实施方式

下面以实施例耐盐富硒红米新品系的创造对本发明进一步说明。

a.不同水稻品种间杂交获得杂种

选择水稻品种9311和海稻86作为杂交亲本，二者杂交获得杂种f1。9311是著名籼稻品种，是超级杂交稻两优培九的父本，综合性状优良。海稻86是耐盐水稻品种，同时其稻米红色，富含钙、镁、铁、锰、锌、硒等矿质营养元素，特别是硒的含量远大于普通水稻品种。

b.杂种种植及花药培养取材

种植杂种f1，植株孕穗期，选取叶枕距10cm、颖壳上部浅绿色下部淡黄色、雄蕊长度接近颖壳长度1/2的稻穗，将稻穗连同外部叶鞘、叶片一起取材。取稻穗不同部位的颖花，挑出花药，用1％i2-ki溶液染色制片观察，确保按上述外部形态标准所取稻穗的花粉大部分处于单核靠边期。

c.材料低温预处理

剪除稻穗上的叶片，保留最后三片叶的叶鞘，用经蒸馏水浸湿的纱布包裹后装入自封袋，封口置于冰箱4℃条件下预处理7～10d。

d.花药培养获得愈伤组织

在超净工作台上剥出低温预处理后的稻穗，经消毒处理后，挑取颖花中的花药接种至花药愈伤组织诱导培养基中，置于26～28℃、黑暗条件下培养，至愈伤组织形成。花药愈伤组织诱导培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

e.愈伤组织离体染色体加倍

将生长旺盛的愈伤组织转移至加倍培养基中，置于26～28℃恒温摇床中，100rpm振荡培养48h。加倍培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+colchicine300～500mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

f.加倍后愈伤组织恢复培养

将加倍处理后的愈伤组织用无菌水冲洗3～5次，接种至恢复培养基中，置于26～28℃、黑暗条件下恢复培养7～10d。恢复培养基配方：sk3+2,4-d1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.5mg/l～1.0mg/l+kt0.5mg/l～1.0mg/l+ch200mg/l+sucrose2.5％+maltose2.5％+agar0.75％，ph6.0。

g.愈伤组织分化出苗

将恢复培养后的愈伤组织转移至分化培养基中，置于25℃、黑暗条件下培养3～5d，再转为光照12～14h/d条件下培养，至分化出苗。分化培养基配方：ms+6-ba1.0mg/l～1.5mg/l+kt1.0mg/l～2.0mg/l+naa0.2mg/l～0.3mg/l+sucrose3％+agar0.75％，ph6.0。

h.芽苗生根培养

待愈伤组织分化出的芽苗长至3～5cm时，将其转入生根培养基中，25℃光照条件下培养，芽苗生根形成完整的小植株。生根培养基配方：1/2ms+6-ba0.1mg/l～0.3mg/l+naa0.3mg/l～0.5mg/l+activatedcarbon0.02％+sucrose2％+agar0.75％，ph6.0。

i.试管苗移栽

待试管苗根数3～5条，根长2～3cm时，揭开培养瓶的封口膜，加入0.5～1cm深的无菌水，25℃炼苗2～3d；用清水洗净试管苗根部的琼脂后，移栽于水田，移栽后最初几天注意遮阳及防淹水过深。

j.倍性鉴定

在形态及结实性上，单倍体植株矮小，茎秆纤细、长势弱，不结实；而加倍成功的加倍单倍体(二倍体)植株较高、茎秆粗壮、可正常结实。通过倍性检测仪检测发现，二倍体植株细胞dna含量是单倍体的两倍。根尖染色体制片发现单倍体的染色体数目为2n＝x＝12，二倍体的染色体数为2n＝2x＝24。

k.综合性状鉴定

观察经鉴定确认的二倍体植株(dh1)，挑选株叶型与9311相同或相近的植株，按单株编号；稻谷成熟后脱壳观察稻米颜色，选留表现为红色稻米者；每株用部分稻米进行硒元素含量检测，根据检测结果，保留硒元素含量高的编号种子。

按单株种植筛选获得的dh1植株的种子，获得dh2株系，按单株收获种子并编号；每个编号取部分种子进行耐盐性测试：先用蒸馏水浸种2d，然后将破胸的种子转入垫有3～5层灭菌滤纸的培养皿中，培养皿中加入用1/4hoagland营养液配制的0.6％nacl溶液，处理10～12d，每天更换新的nacl溶液，同时处理海稻86种子作为对照，筛选出耐盐株系。最终选育获得综合性状优良的耐盐富硒红米新品系。