本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基及其应用。
背景技术：
长梗杜鹃系杜鹃属、杜鹃亚属(subg.rhododendron)、越桔杜鹃组(sect.vireya)、类越桔杜鹃亚组(subsect.pseudovireya)常绿植物。其花朵质地厚实、花色鲜黄，比同属的滇越杜鹃(r.rushforthii)、羊踯躅(r.molle)、鲜黄杜鹃(r.xanthostephanum)、纯黄杜鹃(r.chrysodoron)、硫磺杜鹃(r.sulfureum)等花色更为纯正。国际上，杜鹃花的花色育种趋势为纯色花，特别是黄色和蓝色更为珍贵。更令人称奇的是，与野生杜鹃花期多集中于3～6月不同，长梗杜鹃的自然花期为11月下旬至翌年的2月上旬，在市场上有着巨大的产业发展前景。
此外，长梗杜鹃的分布区极其狭窄，目前已知的仅位于云南省麻栗坡县的4个野生居群，各居群植株数为80～350株，海拔介于1183～1316m。根据iucnredlistcategoriesandcriteria(version3.1)评估标准，长梗杜鹃已经处于极危状态[crb1ab(i,iii,v)]。受人为干扰严重，加之种群内实生苗较少，自然更新较弱，为典型的极小种群野生植物(plantspecieswithextremelysmallpopulations,简称psesp)，野生资源状况令人担忧，亟待保护。
长梗杜鹃为中国特有种，花色纯黄明亮、花期独特，具有极高的观赏价值和市场开发潜力。然而，野外由于分布区单一，数量稀少，加之人为破坏严重，已经处于极度濒危状态。因此开展针对长梗杜鹃的组培快繁研究，不仅对今后开发利用，而且对有效保护该植物资源都刻不容缓，具有重要意义，但是现有的长梗杜鹃组培体系，均存在愈伤组织褐化严重，分化能力低下的问题，从而导致难以获得高质量的长梗杜鹃组培苗。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基及其应用，利用所述培养基可显著降低长梗杜鹃在诱导愈伤组织时的褐化现象，并提高愈伤组织的分化率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基，所述培养基以改良ms为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-ba2.0mg·l-1、2,4-d3.0mg·l-1、蔗糖30g·l-1、琼脂5.5g·l-1、活性炭1g·l-1、精胺4.5mg·l-1、占所述培养基体积10％的椰子汁和阿魏酸48.5mg·l-1。
本发明还提供了所述培养基在获得长梗杜鹃分化芽中的应用。
本发明还提供了一种基于所述培养基的获得长梗杜鹃分化芽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以未成熟的花苞为外植体，将所述外植体接种于所述培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织接种到分化培养基上进行分化培养，得分化芽；所述分化培养基以改良ms为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-ba2.0mg·l-1、蔗糖30g·l-1、琼脂5.5g·l-1、活性炭1.0g·l-1、精胺4.5mg·l-1、所述分化培养基体积10％的椰子汁和阿魏酸48.5mg·l-1。
优选的，步骤(1)所述诱导培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±2℃。
优选的，步骤(2)所述分化培养的温度为25±2℃。
本发明还提供了所述培养基在长梗杜鹃组培快繁中的应用。
本发明还提供了所述培养基在长梗杜鹃种质保存中的应用。
本发明提供了一种长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基，所述培养基中以阿魏酸作为抗褐化剂，经实施例证实，当浓度为48.5mg·l-1时阿魏酸对愈伤组织的生长量抑制不明显，却能显著的降低愈伤组织的褐化指数。本发明还提供了所述培养基的应用，将所述培养基用于获得长梗杜鹃的分化芽或组培苗，或进行长梗杜鹃的种质保存时，选择未成熟的花苞作为外植体，将所述外植体接种到所述培养基中后，得到大量愈伤组织，将愈伤组织接种到含有相同浓度阿魏酸的分化培养基中，可使愈伤组织的分化率达到17.9％，从而在一定程度上解决了长梗杜鹃新品种组培苗难以获得而无法上市的瓶颈问题；外植体的选择还极大扩充了外植体的来源；且可省略外植体消毒的步骤，不仅节约了成本，还能提高愈伤组织质地。
具体实施方式
本发明提供了一种长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基，所述培养基以改良ms为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-ba2.0mg·l-1、2,4-d3.0mg·l-1、蔗糖30g·l-1、琼脂5.5g·l-1、活性炭1g·l-1、精胺4.5mg·l-1、占所述培养基体积10％的椰子汁和阿魏酸48.5mg·l-1。
本发明所述改良ms的母液配方优选如表1所示，本发明对所述改良ms的配制方法并没有特殊限定，优选先配制母液，而后在使用前按比例混合稀释即可。
表1改良ms母液配方
本发明所述培养基中，以阿魏酸作为抗褐化剂，阿魏酸为多酚类，具有很强的抗氧化功效，同时也是一种化感物质，而多酚-蛋白质具有可逆的结合反应有关，导致阿魏酸对酶具有抑制作用，进一步抑制植物的生长。在本发明实施例中，高浓度的阿魏酸会降低愈伤组织诱导率，明显抑制愈伤组织的生长。在愈伤组织继代60d以后，低浓度的阿魏酸可以显著降低愈伤组织的褐化指数，并随着愈伤组织继代的时间延长效果越明显，这与阿魏酸具有强的还原性、抗氧化能力以及对ppo有抑制作用有关；当浓度为48.5mg·l-1时阿魏酸对愈伤组织的生长量抑制不明显，却能显著的降低愈伤组织的褐化指数，使愈伤组织的分化率达到17.9％。
本发明所述培养基中，尤其是在愈伤组织诱导中，6-ba起主导作用，其浓度对愈伤组织的褐化率、褐化指数、出愈量有较大的影响，2,4-d的浓度对愈伤组织的诱导作用不显著，其浓度对愈伤组织的出愈率、褐化率、出愈量影响不显著。本发明对培养基中各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售试剂即可。本发明对所述培养基的配制方法并没有特殊限定，优选将上述组分混合后调节ph值为5.8后，灭菌即可。
本发明还提供了所述培养基在获得长梗杜鹃分化芽中的应用。
利用本发明所述培养基，可对长梗杜鹃进行组织培养，从而获得大量愈伤组织，并利用所述愈伤组织分化出芽，从而进行完整的组培快繁体系，得到高质量的长梗杜鹃组培苗。
本发明还提供了一种基于所述培养基的获得长梗杜鹃分化芽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以未成熟的花苞为外植体，将所述外植体接种于所述培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；
(2)将所述愈伤组织接种到分化培养基上进行分化培养，得分化芽；所述分化培养基以改良ms为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-ba2.0mg·l-1、蔗糖30g·l-1、琼脂5.5g·l-1、活性炭(ac)1.0g·l-1、精胺4.5mg·l-1、所述分化培养基体积10％的椰子汁和阿魏酸48.5mg·l-1。
本发明以未成熟的花苞为外植体，将所述外植体接种于所述培养基上进行诱导培养，得愈伤组织。本发明所述未成熟的花苞在进行所述接种前，优选还包括在无菌条件下，层层剥离所述花苞，取出长度为0.6～1.2cm的未成熟花的子房作为外植体。本发明所述外植体不经消毒即可进行所述接种。本发明在所述接种后进行诱导培养，所述诱导培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为25±2℃。
得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种到分化培养基上进行分化培养，得分化芽；所述分化培养基以改良ms为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-ba2.0mg·l-1、蔗糖30g·l-1、琼脂5.5g·l-1、ac1.0g·l-1、精胺4.5mg·l-1、所述分化培养基体积10％的椰子汁和阿魏酸48.5mg·l-1。本发明所述分化培养的温度优选为25±2℃。在本发明中，所述分化培养每30d转瓶一次。
本发明还提供了所述培养基在组培快繁长梗杜鹃中的应用。本发明对利用所述培养基进行组培快繁长梗杜鹃的具体方法并没有特殊限定，参考其他杜鹃植物即可。
本发明还提供了所述培养基在长梗杜鹃种质保存中的应用。本发明对所述种质保存的具体方法并没有特殊限定，优选利用所述培养基培养得到的分化芽进行常规的传代保存即可。
下面结合实施例对本发明提供的长梗杜鹃用抗褐化愈伤组织诱导培养基及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
供试材料采自栽种于中国林业科学研究院资源昆虫研究所滇中高原试验站的长梗杜鹃(rhododendronlongipedicellatum)。
1、外植体消毒方式对愈伤组织诱导及褐化的影响
在超净工作台中的无菌条件下将长梗杜鹃花苞层层剥离，取出长度为0.6～1.2cm的未成熟花作为外植体，分为二组，第一组不经消毒直接接种至诱导培养基中。第二组(对照)外植体用3％戊二醛表面消毒3min，无菌水清洗4次，再用0.1％的升汞表面消毒3min，无菌水清洗4次，接种至添加阿魏酸的愈伤组织诱导培养基中。对照和处理各接种5瓶，每瓶5个外植体，重复3次。接种后在温度(25±2)℃下暗培养，30d后统计愈伤组织诱导率、褐化率及褐化指数。
其中基础愈伤组织诱导培养基的组成为：改良ms(表1)+6-ba2.0mg·l-1+2,4-d3.0mg·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂5.5g·l-1+椰子汁10％(v/v)+ac1g·l-1+精胺4.5mg·l-1；ph值为5.8。
统计数据分别为：
污染率＝染菌外植体数/接种外植体数×100％；
愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织外植体数/接种外植体数×100％；
愈伤组织分化率＝分化出苗的愈伤组织/愈伤组织总数×100％；
褐化率＝达1级褐化标准以上愈伤组织数/愈伤组织总数×100％；
褐变指数＝∑(褐化级的愈伤组织块数×该褐化级别)/(愈伤组织总数×最高的褐化级别)×100％；
褐变指数表示外植体褐变程度，参照顾之中(1992)的方法，将外植体的褐变程度分为以下五级标准进行统计：0级：褐化部分在25％以下；1级：褐化部分在25％～50％；2级：褐化部分在50％～75％；3级：褐化部分在75％以上但未全部褐化；4级：全部褐化或接近于全部褐化。
试验数据采用microsoftexcel和spss18.0进行统计分析，如表2所示，接种前对外植体分别进行消毒和不消毒处理，接种30d后，未消毒外植体的污染率同消毒后外植体的污染率一致，均为0；经过消毒的外植体褐化率为12.1％、褐化指数为3.9％，而不消毒外植体的褐化率和褐化指数均显著低于消毒处理，分别为1.5％、0.3％；消毒外植体培养出来的愈伤组织质地较疏松、表现出水渍状，呈黄褐色，而不消毒外植体培养出来的愈伤组织质地较致密、无明显的水渍状，呈黄绿色。
表2不同消毒处理对原变种愈伤组织的影响
注：其中同一列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。
2、6-ba和2,4-d浓度组合对愈伤组织诱导及褐化的影响
在基础愈伤组织诱导培养基的基础上，采用2因素区组试验设计，设置6-ba浓度为0.5、1、2、3mg·l-1，2,4-d浓度为1、2、3、4mg·l-1，共组合成16种配方，将外植体在无菌条件下不经消毒接种在愈伤组织诱导培养基上，每个处理接种2瓶，每瓶接种5个外植体，重复3次。30d后统计愈伤组织诱导率、颜色和质地、褐化率、褐化指数。
结果如表3所示，浓度不同的植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响较大，当6-ba的浓度在0.5～3mg·l-1范围内时，低浓度6-ba对外植体的诱导率低，诱导出的愈伤组织褐化率高，出愈量小；高浓度6-ba对外植体的诱导率高，诱导出的愈伤组织褐化率较低，出愈量大；6-ba浓度为2mg·l-1、3mg·l-1时愈伤组织的诱导效果最好。当2,4-d浓度为1～4mg·l-1时，2,4-d的浓度对愈伤组织诱导的影响不大。在一定范围内6-ba浓度同愈伤组织的出愈率呈显著正相关(r＝0.850，p<0.01)，同愈伤组织褐化率呈显著负相关(r＝-0.834，p<0.01)，同愈伤组织出愈量呈显著正相关(r＝0.895，p<0.01)；2,4-d浓度同愈伤组织的出愈率、褐化率、出愈量相关性均不显著。
表3植物生长调节剂对长梗杜鹃愈伤组织的诱导效果
3、不同抗褐化剂种类及其浓度的褐化抑制效应
以长度为0.6～1.2cm的未成熟雄花子房作为外植体，将其在无菌条件下不经消毒接种在添加了不同种类不同浓度抗褐化剂的愈伤组织诱导培养基中：表面添加1mlvc液，vc浓度设置为50、100、200mg·l-1；vc+柠檬酸浓度设置为100:50、100:100、100:150mg·l-1；阿魏酸浓度设置为48.5、97、194mg·l-1；姜汁液浓度设置为0.5、1.5、4.5g·l-1，其中vc以及vc+柠檬酸的混合液采用过滤灭菌法灭菌，阿魏酸和姜汁液采用湿热灭菌法灭菌。以不添加任何抗褐化剂的培养基作为对照，每个处理接种3瓶，每瓶接种5个外植体，重复3次。30d后统计愈伤组织诱导率，褐化率和褐化指数，并转接至添加了与愈伤组织诱导相同抗褐化剂的分化培养基中(基础分化培养基：改良ms+6-ba2.0mg·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂5.5g·l-1+椰子汁10％(v/v)+ac1.0g·l-1+精胺4.5mg·l-1；ph值为5.8。置于25±2℃下培养，转瓶周期为30d)。此后，30d继代一次，直至愈伤组织分化出芽，每次继代前统计褐化率、褐化指数，180d后统计生长量及分化率。
不同种类不同浓度抗褐化剂对愈伤组织的影响如表4所示，添加了不同种类、不同浓度抗褐化剂的愈伤组织诱导培养基都能诱导出愈伤组织，但添加194mg·l-1阿魏酸时愈伤组织的诱导率较低，为63.1％。在继代培养过程中愈伤组织褐化越来越严重，褐化指数不断升高；在分化培养基培养150d后，添加48.5mg·l-1阿魏酸的愈伤组织褐化指数最低，为62.3％；添加了97mg·l-1阿魏酸、0.5g·l-1和1.5g·l-1姜汁的愈伤组织的褐化指数分别为75.1％、77.5％、74.6％，也均显著低于对照；当阿魏酸浓度为194mg·l-1、姜汁浓度为4.5g·l-1时不利于褐化的有效抑制，其愈伤组织褐化指数分别为93.8％、92.4％，均显著高于对照。
愈伤组织生长量在外植体接种30d后表现出差异性，接种120d时差异最为明显，统计120d时的生长量结果表明：添加阿魏酸和姜汁会减少愈伤组织的生长量，且阿魏酸和姜汁的浓度越高其生长量越低，当阿魏酸浓度为194mg·l-1、姜汁浓度为4.5g·l-1时愈伤组织的生长量最低，均为“+”。接种180d后开始有愈伤组织分化出苗，统计愈伤组织的分化率，结果表明：添加48.5mg·l-1、97mg·l-1的阿魏酸和添加0.5g·l-1、1.5g·l-1的姜汁其愈伤组织的分化率均显著高于对照，其中添加48.5mg·l-1阿魏酸的愈伤组织分化率最高，为17.9％；100:150mg·l-1的vc+柠檬酸、194mg·l-1的阿魏酸、4.5g·l-1的姜汁抑制愈伤组织分化，分化率均为0；添加100:50mg·l-1、100:100mg·l-1的vc+柠檬酸混合液和在培养基表面添加1mlvc时其愈伤组织的分化率均同对照差异不显著，为3％左右。可见，褐化抑制效果最好的抗褐化剂为阿魏酸，用量为48.5mg·l-1，分化率可达17.9％。
表4不同种类不同浓度抗褐化剂对愈伤组织的影响
可见，当浓度为48.5mg·l-1时阿魏酸对愈伤组织的生长量抑制不明显，却能显著的降低愈伤组织的褐化指数，使愈伤组织的分化率达到17.9％，较对照的2.9％提高了5倍之多，从而在一定程度上解决了长梗杜鹃新品种组培苗难以获得而无法上市的瓶颈问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。