本发明涉及一种牛精子冻存液及其制备方法。
背景技术：
精液冷冻保存技术是一种先进的动物繁殖技术，其基本原理是通过降低或抑制精子新陈代谢强度达到延长精子在体外存活时间的目的冷冻精液解决了精液长期保存问题，使输精不受时间、地域与种畜生命的限制，极大地优良公畜的利用率，提高了经济效益。
目前市面上已有的精子冻存液大部分添加了卵黄，但是卵黄来源于鸡蛋，鸡蛋的批次不同成分含量也不尽相同，使产品质量不稳定，并且蛋黄里面的生物活性蛋白物质可能引发潜在过敏反应，在后期清洗中难以去除。
在逐级低温冻存和复苏的过程中，精子细胞会发生氧化反应，导致精子凋亡。而目前的产品几乎没有针对氧化应激的措施。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种牛精子冻存液及其制备方法，解决现有产品中添加卵黄物质带来的稳定性问题，以及冻存过程中精子的氧化应激反应。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种牛精子冻存液，包括a液和b液，以所述a液的质量计，所述a液包括以下组分：
35.0±0.5gtris，17.0±0.5g柠檬酸，12.5±0.5g果糖，30±0.5g改性卵磷脂，1000000iu庆大霉素，以注射用水溶解；
以所述b液的质量计，所述b液包括以下组分：
35.0±0.5gtris，17.0±0.5g柠檬酸，12.5±0.5g果糖，30±0.5g改性卵磷脂，12％甘油，1000000iu庆大霉素，以注射用水溶解。
进一步地，所述牛精子冻存液a液中还包括以下组分：0.2±0.05g芝麻酚，1.0±0.1g番茄红素，0.04±0.01g黄岑素，20±0.5gβ-乳球蛋白。
进一步地，所述a液制备方法包括以下步骤：
s1、按配方称取tris、柠檬酸、果糖，溶于500ml注射用水中；
s2、将改性卵磷脂溶于300ml注射用水中后与s1中所得溶液混合；
s3、将s2中所得溶液定容至1l，调节ph后经过0.22μm滤膜过滤；
s5、将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2-8℃避光保存；
所述b液制备方法包括以下步骤：
s1、按配方称取tris、柠檬酸、果糖，溶于500ml注射用水中；
s2、将改性卵磷脂溶于300ml注射用水中后与s1中所得溶液混合；
s3、向所述s2所得混合液中加入甘油，庆大霉素；
s4、将s3中所得溶液定容至1l，调节ph后经过0.22μm滤膜过滤；
s5、将s4中配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2-8℃避光保存。
进一步地，所述a液与b液制备方法中所用注射用水均为55℃。
进一步地，所述a液制备方法中，s2中所得混合液中还加入有芝麻酚、番茄红素、黄岑素、β-乳球蛋白和庆大霉素。
进一步地，所述a液与b液ph均为6.7～6.9。
进一步地，所述a液以及b液通过naoh和hcl调节ph。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1)通过使用改性卵磷脂代替卵黄，使产品稳定性增强。
2)通过添加芝麻酚、番茄红素、黄岑素、β-乳球蛋白，提高精子解冻后质量以及抗氧化能力。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
实施例1
a液的制备：
称取35gtris，17g柠檬酸和12.5g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取30g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入0.2g芝麻酚，1g番茄红素，0.04g黄岑素，20gβ-乳球蛋白以及1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
b液的制备：
称取35gtris，17g柠檬酸和12.5g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取30g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入120ml甘油和1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
实施例2
a液的制备：
称取34.5gtris，16.5g柠檬酸和12g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取29.5g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入0.15g芝麻酚，0.9g番茄红素，0.03g黄岑素，19.5gβ-乳球蛋白以及1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
b液的制备：
称取34.5gtris，16.5g柠檬酸和12g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取32.5g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入120ml甘油和1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
实施例3
称取35.5gtris，17.5g柠檬酸和13g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取30.5g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入0.25g芝麻酚，1.1g番茄红素，0.05g黄岑素，20.5gβ-乳球蛋白以及1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
b液的制备：
称取35.5gtris，17.5g柠檬酸和13g果糖，将上述组分溶于500ml注射用水中；称取33.5g改性卵磷脂，溶于300ml55℃注射用水中后与上述混合液混合；向上述混合液中加入120ml甘油和1000000iu庆大霉素；将上述溶液定容至1l，采用hcl或naoh将溶液ph调整至6.8后经过0.22μm滤膜过滤，将配置好的溶液按每瓶100ml无菌分装，2～8℃避光保存。
其中牛精液冻存包括以下步骤：
a.将a液与待稀释的牛精液按照体积比1：15混合；
b.向上述精子液体中加入与精子液体等体积的b液，静置5分钟；
c.将上述混合液置于冻存管内，依次在4℃，-20℃，-80℃环境下放置5分钟；
d.最后将冻存管冻存于液氮中。
当需将牛精液进行复苏时，将冻存管从液氮中取出后迅速在37度振荡复温20s即可。
取10份精子洗涤后计算前向运动的精子比例，然后上述冻存步骤分别使用实施例一、二、三以及市售牛冻存液作为对照进行冻存。在液氮中10分钟后取出进行复苏，复苏之后再次计算前向运动的精子比例。结果如下：
其中冻存复苏率＝冻前活率/冻后活率*100％。
对比实验组一二三与对照组，本发明液可显著提升解冻后精子活力水平，从而增加人工授精的受孕率。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。