一种牧草种子脱毒处理方法与流程

本发明属于牧草种子脱毒处理技术领域，尤其涉及一种牧草种子脱毒处理方法。

背景技术：

牧草种子，很一大部分是乡土植物，也有一部分是从国外引进，经我国多地多年种植比较高产，本土化了的。种子实体既包括牧草籽实，也包括限于气候条件，栽培繁殖牧草所使用的块根、种茎。有抗旱、耐盐碱的牧草新品种——腾格里无芒隠子草，也有耐荫耐湿耐高温适合林下屋边种植的耐阴草等较多品种。牧草包括藤本植物、半灌木和灌木。主要有豆科、禾本科、莎草科、蓼科、苋科、菊科、黎科等不同科属，豆科牧草主要有紫花苜蓿、hny-mc杂花苜蓿、草木樨、hny-mc沙打旺、红豆草、柠条、柱花草、绿叶山蚂蝗、hny-mc三叶草等；禾本科牧草主要有冰草、无芒雀麦、披碱草、老芒麦、羊茅类、猫尾草、碱茅、鸭茅、苏丹草、杂交高梁、hny-mc饲料玉米(墨西哥类玉米)、hny-mc多年生黑麦草、一(越)年生黑麦草、狼尾草、狗尾草、雀稗类、象草、臂形草等；其它科牧草主要有hny-mc籽粒苋、木地肤、hny-mc串叶松香草等。然而，现有牧草种子脱毒处理方法培育的牧草种子营养价值低；同时，对牧草种子脱毒效果差。

综上所述，现有技术存在的问题及缺陷是：现有牧草种子脱毒处理方法培育的牧草种子营养价值低；同时，对牧草种子脱毒效果差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牧草种子脱毒处理方法。

本发明是这样实现的，一种牧草种子脱毒处理方法，所述牧草种子脱毒处理方法包括以下步骤：

步骤一，在牧草种子萌发过程中，在种子根部喷洒药液，持续8～12天，并在夜晚追加2～4h光照；通过对牧草植株生长周期的管控，选择符合优良性状的植株，并将其作为采集牧草种子的候选植株。

步骤二，待11月上旬，在种子成熟时采集候选植株上籽粒饱满、健康的牧草种子，同时去除混杂于牧草种子中的杂质；对牧草种子进行分选，去掉牧草种子的种荚或者种壳，获取质量和粒径一致的牧草种子。

步骤三，将分选的籽粒饱满，无病害的牧草种子在常温的条件下用去离子水浸泡36～48h后，清洗干净，再进行表面消毒；同时对牧草种子进行干燥处理，储藏待用。

步骤四，第二年开春后，取出储藏的种子，使用质量分数为1.5％的过氧化氢水溶液清洗干净，干燥处理，待用。

步骤五，配置基础培养基：选取原料蜜环菌发酵液1份、红豆杉提取液2份、麦芽糖5份、麸皮10份、甜菜渣5份、甘蔗渣6份、豆粕5份、菜籽饼10份、草木灰11份、琼脂4份混合配置基础培养基。

步骤六，将消毒后的牧草种子进行层积处理，用湿布覆盖其表面，进行催芽5～6d，温度控制在26～27℃，诱导牧草种子出芽。

步骤七，在无菌的条件下，将芽尖切下，再在无菌条件下置于65％的酒精溶液中浸泡8～10s，除去酒精溶液，无菌水浸洗4～6次，将芽尖移入具有基础培养基的容器中进行基础培养。

步骤八，取经步骤七所述基础培养阶段后的牧草种子芽尖，通过脱毒培养基中的菌种对牧草种子进行脱毒培养，盛放脱毒培养基的容器需提前进行消毒处理，得到的组培苗在42～45℃下进行热处理30～35d后，剥取0.2cm的茎尖，所得茎尖为牧草种子脱毒苗。

步骤九，对步骤八得到的牧草种子脱毒苗进行扩繁培养，将牧草种子脱毒苗在扩繁培养基中进行培养。

步骤十，选取原料谷氨酸1.1mg/l、有机硒0.16mg/l、七水硫酸亚铁0.4mg/l，龙葵提取液0.4mg/l，钼酸钠0.16mg/l，氯化钴0.16mg/l，吲哚乙酸0.16mg/l混合配置生长素。

步骤十一，在无菌的操作条件下，将扩繁后的苗接种在装有生长素的培养基上，经过7代的增殖继代培养。

步骤十二，对培养后的牧草种子组织培养苗进行生根繁育；将生根繁育后的秧苗，移至强光照下炼苗4～5d；炼苗后，将其移栽到基质中，生长稳定后移栽到田间。

进一步，步骤一中，所述在种子根部喷洒的药液的制备方法如下：

(i)按质量份数计，取半边莲10份、鸭跖草8份、蟾蜍草15份洗净后切碎，加水250份小火煎煮10～15min，过滤除杂，冷却至室温，得中药液；

(ii)按质量份数计，取牧草病叶10份洗净后切碎，加水120份，充分搅拌，静置15～20min后，过滤除杂，得溶液a；

(iii)将所述溶液a加热至65～75℃保温6～10min，得溶液b；将所述中药液、溶液b按质量比3:1混合后，于常温下搅拌处理3～5min后即得。

进一步，步骤一中，所述在种子根部喷洒药液的方法为：日间每隔2～2.5h喷洒一次，喷洒量每串种子8～12ml。

进一步，步骤一中，所述夜晚追加的光照的强度为300～700lx，光照时间为2～4h。

进一步，步骤三中，所述对牧草种子进行储藏的方法如下：

将处理好的种子置于0～4℃冷库中冷藏10～15天，取出后与湿沙混合，使用低温沙藏方法储藏。

进一步，所述湿沙由水、丝氨酸、谷氨酸、肌醇、木质素磺钠按质量比300:3:2:1:3均匀混合后制得营养液，再将所述营养液与细沙按质量比1:1～2混合后制得。

进一步，所述细沙，需经过200～300℃高温炙烤处理。

进一步，步骤八中，所述脱毒培养基中菌种的制备方法如下：

(1)将脱毒培养基封口后进行灭菌，将脱毒培养基调温至25℃，接着将脱毒菌种接种至脱毒培养基的青霉素料层表面；

(2)将接种后的脱毒培养基于25～27℃恒温培养，菌丝不断成长，待菇体在菌丝成长层形成后，向空腔内通入无菌空气，菇体在空腔内成长；

(3)将成长后的菇体作组织分离，得到脱毒菌种，扩繁母种；通过无菌操作将到脱毒菌种的转接至平面培养基上，培养至菌丝发满，得到母种；

(4)在液体培养基上通过无菌操作接入得到的母种之中，25℃下静止培养2～3天，启动磁力搅拌进行培养，并制作种子罐；将得到的药瓶种接种至发酵罐内，于25～27℃下进行培养。

进一步，所述种子罐的制作方法如下：

1)洗罐，加水至罐容量的75％，加热升温至80～85℃；

2)向罐体内加入质量分数为1.8％的培养基，1％的白糖，0.1％的食用油，升温至120～130℃，保温1～2h；

3)将发酵罐料温降至25℃，通过无菌操作接入培养好的摇瓶种；

4)于25℃，进行培养，培养后的菌种再接种至发酵罐内进行培养。

进一步，步骤十一中，所述培养条件为：光照强度为2900～3200lx，环境温度为25～27℃时，1/2ms培养基条件下生长，光周期16小时/天。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过提供的牧草种子培育方法可以大大提高牧草种子的营养价值；在种子刚刚萌发阶段喷洒药液，能使所述药液中的灭活病毒作用于种子上，在种子萌发初期，种胚细胞代谢强度最高，此时使用灭活病毒胁迫锻炼，有助于种子抗病有关的基因的表达和酶的合成，大大提升了牧草对病毒的抵抗能力，有效降低其生长发育过程中的病害发生率。同时，通过提供的脱毒培养基中的菌种制备方法制备的菌种可以大大提高脱毒培养基对牧草种子的脱毒效果。

附图说明

图1是本发明实施提供的牧草种子脱毒处理方法流程图。

图2是本发明实施提供的在种子根部喷洒的药液的制备方法流程图。

图3是本发明实施提供的牧草种子培育方法流程图。

图4是本发明实施提供的脱毒培养基中的菌种制备方法流程图。

图5是本发明实施提供的对牧草种子脱毒苗进行组织培养方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例提供的牧草种子脱毒处理方法包括以下步骤：

s101，在牧草种子萌发过程中，在种子根部喷洒药液，持续8～12天，并在夜晚追加2～4h光照；通过对牧草植株生长周期的管控，选择符合优良性状的植株，并将其作为采集牧草种子的候选植株。

s102，待11月上旬，在种子成熟时采集候选植株上籽粒饱满、健康的牧草种子，同时去除混杂于牧草种子中的杂质；对牧草种子进行分选，去掉牧草种子的种荚或者种壳，获取质量和粒径一致的牧草种子。

s103，将分选的籽粒饱满，无病害的牧草种子在常温的条件下用去离子水浸泡36～48h后，清洗干净，再进行表面消毒；同时对牧草种子进行干燥处理，储藏待用。

s104，第二年开春后，取出储藏的种子，使用质量分数为1.5％的过氧化氢水溶液清洗干净，干燥处理，待用。

s105，通过基础培养基对牧草种子进行培育。

s106，取上述基础培养阶段后的牧草种子芽尖，通过脱毒培养基中的菌种对牧草种子进行脱毒培养，盛放脱毒培养基的容器需提前进行消毒处理，得到的组培苗在42～45℃下进行热处理30～35d后，剥取0.2cm的茎尖，所得茎尖为牧草种子脱毒苗。

s107，对牧草种子脱毒苗进行扩繁培养，将牧草种子脱毒苗在扩繁培养基中进行培养；对牧草种子脱毒苗进行组织培养。

s108，将生根繁育后的秧苗，移至强光照下炼苗4～5d，炼苗后，将其移栽到基质中，生长稳定后移栽到田间。

如图2所示，本发明实施例提供的步骤s101中，所述在种子根部喷洒的药液的制备方法如下：

s201，按质量份数计，取半边莲10份、鸭跖草8份、蟾蜍草15份洗净后切碎，加水250份小火煎煮10～15min，过滤除杂，冷却至室温，得中药液。

s202，按质量份数计，取牧草病叶10份洗净后切碎，加水120份，充分搅拌，静置15～20min后，过滤除杂，得溶液a。

s203，将所述溶液a加热至65～75℃保温6～10min，得溶液b；将所述中药液、溶液b按质量比3:1混合后，于常温下搅拌处理3～5min后即得。

本发明实施例提供的步骤一中，所述在种子根部喷洒药液的方法为：日间每隔2～2.5h喷洒一次，喷洒量每串种子8～12ml。

本发明实施例提供的步骤一中，所述夜晚追加的光照的强度为300～700lx，光照时间为2～4h。

本发明实施例提供的步骤三中，所述对牧草种子进行储藏的方法如下：将处理好的种子置于0～4℃冷库中冷藏10～15天，取出后与湿沙混合，使用低温沙藏方法储藏。

本发明实施例提供的湿沙由水、丝氨酸、谷氨酸、肌醇、木质素磺钠按质量比300:3:2:1:3均匀混合后制得营养液，再将所述营养液与细沙按质量比1:1～2混合后制得；所述细沙需经过200～300℃高温炙烤处理。

如图3所示，本发明实施例提供的步骤s105中，所述牧草种子培育方法，包括：

s301，选取原料蜜环菌发酵液1份、红豆杉提取液2份、麦芽糖5份、麸皮10份、甜菜渣5份、甘蔗渣6份、豆粕5份、菜籽饼10份、草木灰11份、琼脂4份混合配置基础培养基。

s302，将消毒后的牧草种子进行层积处理，用湿布覆盖其表面，进行催芽5～6d，温度控制在26～27℃，诱导牧草种子出芽。

s303，在无菌的条件下，将芽尖切下，再在无菌条件下置于65％的酒精溶液中浸泡8～10s，除去酒精溶液，无菌水浸洗4～6次，将芽尖移入具有基础培养基的容器中进行基础培养。

如图4所示，本发明实施例提供的步骤s106中，所述脱毒培养基中菌种的制备方法如下：

s401，将脱毒培养基封口后进行灭菌，将脱毒培养基调温至25℃，接着将脱毒菌种接种至脱毒培养基的青霉素料层表面。

s402，将接种后的脱毒培养基于25～27℃恒温培养，菌丝不断成长，待菇体在菌丝成长层形成后，向空腔内通入无菌空气，菇体在空腔内成长。

s403，将成长后的菇体作组织分离，得到脱毒菌种，扩繁母种；通过无菌操作将到脱毒菌种的转接至平面培养基上，培养至菌丝发满，得到母种。

s404，在液体培养基上通过无菌操作接入得到的母种之中，25℃下静止培养2～3天，启动磁力搅拌进行培养，并制作种子罐；将得到的药瓶种接种至发酵罐内，于25～27℃下进行培养。

本发明实施例提供的种子罐的制作方法如下：

1)洗罐，加水至罐容量的75％，加热升温至80～85℃。

2)向罐体内加入质量分数为1.8％的培养基，1％的白糖，0.1％的食用油，升温至120～130℃，保温1～2h。

3)将发酵罐料温降至25℃，通过无菌操作接入培养好的摇瓶种。

4)于25℃，进行培养，培养后的菌种再接种至发酵罐内进行培养。

如图5所示，本发明实施例提供的步骤s107中，所述对牧草种子脱毒苗进行组织培养方法如下：

s501，选取原料谷氨酸1.1mg/l、有机硒0.16mg/l、七水硫酸亚铁0.4mg/l，龙葵提取液0.4mg/l，钼酸钠0.16mg/l，氯化钴0.16mg/l，吲哚乙酸0.16mg/l混合配置生长素。

s502，在无菌的操作条件下，将扩繁后的苗接种在装有生长素的培养基上，在光照强度为2900～3200lx，环境温度为25～27℃时，1/2ms培养基条件下生长，光周期16小时/天，经过7代的增殖继代培养。

s503，对培养后的牧草种子组织培养苗进行生根繁育。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。