一种抑制浸矿细菌生物膜的组合物及其应用

1.本发明属于矿山修复领域，具体涉及一种抑制浸矿细菌生物膜的组合物及其应用。


背景技术：

2.一般认为，自然界中99%的微生物的生存策略都是通过群体感应（qs）形成生物膜的形式附着在固体表面进行定植生长。同时，生物膜也是导致细菌产生耐药性的重要因素，它具有很高的细胞密度。有研究数据表明，生物膜中每克湿重的细菌数量可以达到108到10
11
个，从人的牙齿、肺等各种器官，到各种植入人体的各种医疗设备，再到自然界岩石表面，生物膜的影子无处不在。
3.生物膜是被含有多糖、蛋白质、脂类等物质的胞外多聚物包裹着的有组织的细菌群落，对于外部的环境压力具有高度耐受性。研究认为，人类65
‑
80%的感染都与细菌形成生物膜有关，如果患者被形成生物膜的病原体感染，即使使用高剂量的抗生素也难以治疗，并可能导致其死亡，例如，要治疗和根除患者的病原性细菌生物膜，与相同的浮游菌体相比，它需要的抗生素剂量要提高10
‑
1000倍。
4.如今许多学者正在寻找通过人工或合成的小分子化合物来控制细菌的群体感应（qs）过程，从而抑制生物膜形成的相关研究，并且发现这些qs抑制剂是通过影响细菌交流而影响生物膜，而不是通过杀菌的方式，因此也不会使细菌产生耐药性，不会影响细菌正常生长，对宿主的不良影响也很小。鉴于此，人们提出了将常规抗生素与可降低生物膜水平的qs抑制剂联合作用对抗病原菌耐药性的策略，目前已经有在p. aeruginosa、s. aureus、mycobacterium smegmatis、neisseria subflava及bacillus thuringiensis等相关菌株做了体外研究并取得一定有益效果，而利用qs抑制剂与杀菌剂联用抑制浸矿细菌的相关研究还未见报道。
5.因此，本发明提供了一种抑制浸矿细菌生物膜的组合物及其应用，具体地，将qs抑制剂与杀菌剂十二烷基硫酸钠（sds）联合应用于治理矿山重金属污染，本发明所公开的组合物能显著提高杀菌剂的作用，且不会影响细菌的正常生长，仅仅通过干扰细菌之间的信号交流，阻止浸矿细菌在矿石表面形成生物膜，就能显著抑制矿石中重金属离子的溶出，不会对细菌产生耐药性，也不会给环境带来二次污染，是一种有潜力的从源头治理矿山重金属污染的环保制剂。


技术实现要素：

6.本发明提供一种抑制浸矿细菌生物膜的组合物，所述组合物包含质量比为40—160：20—40的qs抑制剂和杀菌剂，所述杀菌剂为十二烷基硫酸钠，所述qs抑制剂的化学结构式为：
、或，分别编号为c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3。
7.本发明还提供一种将所述组合物用于治理矿山重金属污染的应用。
8.本发明还提供一种将所述组合物用于抑制浸矿细菌产生的生物膜的应用。
9.进一步地，所述浸矿细菌为嗜酸氧化亚铁硫杆菌（acidithiobacillus ferrooxidans，dlc
‑
5）。
10.本发明主要以a. ferrooxidans dlc
‑
5为研究对象，通过将3种可降低浸矿细菌生物膜的qs抑制剂与杀菌剂十二烷基硫酸钠（sds）联合作用之后，对浸矿细菌的具体抑菌效果进行评价。
11.本发明的有益效果为：本发明所公开的组合物不仅能够抑制浸矿细菌生长，而且能够抑制浸矿细菌在矿石表面形成生物膜，显著降低了矿石中重金属离子的溶出，不会给环境带来二次污染，是一种有潜力的从源头治理矿山重金属污染的环保制剂。
附图说明
12.图1为qs抑制剂c
‑
1处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
13.图2为qs抑制剂c
‑
2处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
14.图3为qs抑制剂c
‑
3处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
15.图4为qs抑制剂c
‑
1处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜形成的影响。
16.图5为qs抑制剂c
‑
2处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜形成的影响。
17.图6为qs抑制剂c
‑
3处理48h后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜形成的影响。
18.图7为杀菌剂sds作用于a.ferrooxidans dlc
‑
5的最低抑菌浓度。
19.图8为qs抑制剂c
‑
1与sds联用对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
20.图9为qs抑制剂c
‑
2与sds联用对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
21.图10为qs抑制剂c
‑
3与sds联用对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
23.实施例一 qs抑制剂对浸矿细菌生长的影响。
24.1. 实验菌株a. ferrooxidans dlc
‑
5（cctcc
‑
m 2014362）分离自黑龙江五大连池矿山酸性废水，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctcc no：m2014362（保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2014年7月28日）。
25.2. 培养基和主要试剂9k液体培养基：该液体培养基由a液（基础盐溶液）和b液（能源物质）按一定体积均匀混合而成。
26.a液：准确称取3.0g (nh4)2so4，0.5g k2hpo4，0.5g mgso4
·
7h2o，0.1g kcl，
0.01g ca(no3)2溶解于700ml蒸馏水中，使用浓硫酸调节ph为2.0，121℃灭菌15min。
27.b液：准确称取44.7g feso4
·
7h2o于300ml蒸馏水中，完全溶解之后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
28.主要试剂：qs抑制剂c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3（自行合成），分子结构式分别为：、、。
29.3. 实验方法。
30.将活化好的菌株以10%的接种量接入新鲜的9k培养基中，30℃，150r/min条件培养至对数期后，过滤浸矿细菌培养液以除去杂质后于离心机10000r/min高速离心10min，收集菌体沉淀。用新鲜的2k液体培养基（基础盐溶液与9k液体培养基相同，fe
2+
浓度为2g/l）重悬，调整其od600=0.1,设置5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、80mg/l、90mg/l、100mg/l、120mg/l、140mg/l、160mg/l等含有不同浓度、不同化合物的菌液，加入96孔板中，每孔150
µ
l，以不含qs抑制剂的菌液（含终浓度0.1%的dmso）作为对照组，于30℃条件下在恒温培养箱中培养48h，用酶标仪于600nm处测其光吸收值，每组做6个平行孔。
31.4. 实验结果。
32.为了确定化合物的有效使用浓度，测定了qs抑制剂c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3在一定浓度梯度下对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响，如图1
‑
3所示。从图1
‑
3中可以看出，与对照组相比，3种qs抑制剂化合物在5
‑
160mg/l的使用浓度范围内，对细菌a.ferrooxidans dlc
‑
5的正常生长没有影响（p>0.05）。
33.实施例二 qs抑制剂对浸矿细菌生物膜的影响。
34.用实施例一所述方法培养浸矿细菌结束后，将96孔板内的菌液用移液枪吸掉，于每孔中加入280μl灭菌水洗涤3次，以除去游离的菌体，之后将96孔板倒扣于滤纸上将孔内残留的液体吸干，室温条件下往每孔中加入0.5%的结晶紫溶液150μl染色15min；染色结束后，将孔内的结晶紫染料吸掉，继续加入280μl无菌水洗涤3遍，然后于滤纸上将残留液体拍干，向每孔中加入33%的乙酸溶液150μl，将孔壁上的生物膜—结晶紫复合物复溶，用酶标仪在570nm处测其光吸收值。
35.图4
‑
6显示了不同浓度的qs抑制剂c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3分别在处理48h之后对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜形成的影响。从图4
‑
6中可以看出，三种qs抑制剂在一定浓度范围内均对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜的形成显示出一定抑制作用（p<0.05），其中qs抑制剂c
‑
2、c
‑
3的抑制效果与浓度呈正相关，在160mg/l的浓度下对生物膜的抑制率分别达到28.8%和26.5%，而qs抑制剂c
‑
1对a.ferrooxidans dlc
‑
5生物膜的抑制作用效果不及c
‑
2、c
‑
3，在高浓度下的抑制效果反而降低，900mg/l的浓度下抑制效果最佳，为9.1%。
36.实施例三 杀菌剂sds对a. ferrooxidans dlc
‑
5最低抑菌浓度（mic）测定。
37.采用实施例一所述方法处理得到菌体沉淀后，用新鲜的9k液体培养基重悬调整od600=0.1，设置320mg/l、160mg/l、80mg/l、40mg/l、20mg/l、10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、1.25mg/l等含有不同浓度杀菌剂sds的菌液加入96孔板中，每孔200
µ
l，以不含杀菌剂sds的菌液作为对照组，在恒温培养箱中于30℃培养48h，用酶标仪于600nm处测其光吸收值，每组做6个平行孔。
38.图7显示了培养48h之后，杀菌剂sds在不同浓度梯度下对a.ferrooxidans dlc
‑
5生长的影响，从图中可以看出，随着浓度的不断增加，杀菌剂sds在80mg/l的浓度时对a.ferrooxidans dlc
‑
5显现出最佳的抑制效果，我们以完全抑制细菌生长的浓度作为最低抑菌浓度（mic），即杀菌剂sds对a.ferrooxidans dlc
‑
5的最低抑菌浓度为80mg/l（p<0.5）。另外我们发现当浓度继续升高时，od值有缓慢增加的趋势，这主要是由于sds本身浓度升高会对吸光值造成影响。
39.实施例四 qs抑制剂与杀菌剂sds联用效果评价。
40.采用实施例一所述方法处理得到菌体沉淀，然后用新鲜的9k液体培养基重悬调整od600=0.1，设置含有不同终浓度的qs抑制剂与杀菌剂sds的组合，具体为qs抑制剂+杀菌剂sds：（0+0）mg/l、（0+40）mg/l、（0+20）mg/l、（160+0）mg/l、（160+40）mg/l、（160+20）mg/l、（140+20）mg/l、（120+20）mg/l、（100+20）mg/l、（80+20）mg/l、（40+20）mg/l，将组合后的不同菌液加入到96孔板中，每孔200
µ
l，于30℃条件下在恒温培养箱中培养48h，用酶标仪于600nm处测其光吸收值，每组做6个平行。
41.图8
‑
10显示了qs抑制剂c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3与杀菌剂sds的联合作用效果。从图8
‑
10中可以得知，3种qs抑制剂与杀菌剂sds联用后均显示出一定效果，其中当qs抑制剂c
‑
3的使用浓度为160mg/l时，作用效果最明显，这与前边棋盘法的实验结果一致。与qs抑制剂c
‑
3联合作用之后，杀菌剂sds对a.ferrooxidans dlc
‑
5的mic值从80mg/l下降到40mg/l，并且单独作用与联合作用相比，当sds在20mg/l的使用浓度下，od值也会下降50%左右，显示出了良好的作用效果（p<0.5）。综上所述，杀菌剂sds与qs抑制剂的联用，提升了杀菌剂sds的杀菌效果，相较于单独使用sds，杀菌剂sds与qs抑制剂的最低抑菌浓度更低，抑菌效果更明显。