一株马胃葡萄球菌在防治果蔬病害上的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株马胃葡萄球菌在防治果蔬病害上的应用。


背景技术：

2.由黑腐皮壳菌(vslsa mali)引起的苹果树腐烂病，是对苹果产业威胁最大的一种毁灭性病害，该病可危害苹果树主枝和主干，导致皮层腐烂，造成死枝死树，甚至毁园。2008年，全国范围内调查发现，我国苹果主产区腐烂病的整体发病率为52％，部分地区发病率高达85％以上；2011年，苹果树腐烂病在我国烟台苹果产区再次猖獗发生，造成严重经济损失。自1961年，苹果树腐烂病在我国首次发现以来，该病已经造成了4次大流行，相关研究者指出我国苹果产业正面临腐烂病第5次大流行的威胁。
3.目前，生产上尚无腐烂病抗病种植资源可利用，而且外科手术治疗也无法有效控制病害发生。腐烂病菌是典型丝体营养型菌，主要通过剪据口、各种微伤口及表皮死组织等侵染或长期潜伏，依靠化学药剂进行防治很难实现。最近，研究发现腐烂病菌可以在苹果树木质部内快速生长，进行纵向扩展，但不表现明显的外部症状，直至病菌到达皮层组织后才能导致树体发病；由于病菌存在于木质部，通过刮治等外科手术仅能去除皮层的病原菌，而无法去除木质部内菌丝，这也是导致腐烂病病疤重犯的主要原因。
4.由于缺乏针对性强、效果好的防治策略和技术，腐烂病一直是我国苹果生产上的重大防治难题。药剂涂干可以有效预防苹果树腐烂病的发生，但药剂持效期不能维持果树的整个生长期，此项措施费时费工，在很多苹果产区的应用受到限制，且化学农药大量使用不符合我国现代农业减肥减药的发展战略。
5.采用生防菌剂防治苹果树腐烂病对环境友好，可以避免化学防治带来的一系列问题。但是，目前现有技术中还没有利用马胃葡萄球菌防治苹果树腐烂病的报道。如何解决上述问题，是目前微生物领域需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供一株马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)f1在果树病害防治上的应用，马胃葡萄球菌f1对多种果蔬病害(如苹果树腐烂病菌、梨树腐烂病菌、桃褐腐病菌、苹果炭疽叶枯病菌以及苹果轮纹病菌)具有高效抑菌效果，抑菌谱较广，可广泛应用于果蔬病害的防治，具有防治效果稳定，对环境友好的优点。
7.本发明的技术方案具体如下：
8.第一方面，本发明提供一株马胃葡萄球菌在防治果蔬病害上的应用，其该菌株被命名为马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)f1，其保藏号为cgmcc no.21658；所述果蔬病害为苹果树腐烂病菌、梨树腐烂病菌、桃褐腐病菌、苹果炭疽叶枯病菌或苹果轮纹病菌。
9.马胃葡萄球菌f1于2021年1月18日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心，其保藏号为cgmcc no.21658，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
10.第二方面，本发明还提供一种利用所述马胃葡萄球菌f1制备的生防菌剂在果蔬病害防治上的应用，所述生防菌剂的活性成分为菌株f1发酵上清液或菌株f1菌悬液。所述果蔬病害包括苹果树腐烂病、梨树腐烂病、桃褐腐病、苹果炭疽叶枯病和苹果轮纹病。
11.本发明还提供苹果树腐烂病生防菌剂，活性成分为马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)f1的发酵上清液或菌悬液。
12.优选地，所述苹果树腐烂病生防菌剂中，马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)菌株f1的浓度为10
5-109cfu
·
ml-1
。
13.进一步优选地，苹果树腐烂病生防菌剂是浓度为109cfu
·
ml-1
的马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)菌株f1菌悬液。
14.本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)将菌株f1划线接种在pda培养基中，于28℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株f1单菌落a；
16.(2)将所述活化的菌株f1单菌落a，接种于装瓶量80ml/250ml的pdb培养基中，180r
·
min-1
，28℃恒温震荡培养48h，得到菌株f1发酵种子液b；
17.(3)将所述发酵种子液b按1:100的接种量，接种到pdb培养基中扩大培养，28℃恒温震荡培养48h，得到109cfu
·
ml-1
f1菌株的细胞培养液c；
18.(4)将109cfu
·
ml-1
f1菌株的细胞培养液c，在4℃条件下，12000r
·
min-1
离心15min，收集的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到菌株f1发酵上清液，即为生防菌剂；收集f1菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液，即为生防菌剂。
19.第三方面，本发明还提供一种诱导果树枝条抗病性的方法，该方法为：向果树枝条表面施用前述的马胃葡萄球菌的菌液。
20.优选地，所述诱导果树枝条抗病性的方法中，具体施用方法为：向果树枝条表面进行喷洒或者将涂抹上述的马胃葡萄球菌的菌液。
21.优选地，采用的马胃葡萄球菌的菌液的浓度不低于109cfu
·
ml-1
。
22.有益效果：
23.1、本发明提供的马胃葡萄球菌f1对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株f1可有效抑制苹果树腐烂病菌的菌丝生长和孢子萌发，对苹果树腐烂病的防效可达65％以上；菌株f1能够诱导苹果组织内多种防御相关酶活性增加，提高果树抗病相关基因表达水平。
24.2、本发明提供的苹果树腐烂病生防菌剂具有防治效果稳定，对环境友好等特点，适合进行大规模生产，发酵工艺简单，生产成本低廉，具有很好的市场前景。
25.3、本发明提供的诱导果树枝条抗病性的方法操作简单，成本低，可广泛用于果树腐烂病等病害的提前预防，从而大幅度降低果树发病率和治疗成本。
附图说明
26.图1为菌株f1在lb培养基上的菌落形态；
27.图2为菌株f1提取dna的16s rdna序列pcr扩增示意图；
28.其中，图中m为核酸marker dl2000；图中1为菌株f1基因组dna的16s rdna序列扩
增结果；
29.图3为菌株f1对苹果树腐烂病菌菌丝生长(a)和孢子萌发(b)的影响；
30.其中，图中a为菌株f1对苹果树腐烂病菌的抑制效果；图中b为菌株f1菌体和上清液对腐烂病菌孢子萌发的影响；
31.图4为菌株f1上清液对苹果树腐烂病的防治效果；
32.其中，图中a为苹果枝条接种pdb培养基后再接种腐烂病菌的对照；图中b为菌株f1上清液对苹果树腐烂病的防治效果；
33.图5为菌株f1菌悬液处理对苹果枝条组织中防御相关酶活性的影响；
34.图6为菌株f1菌悬液处理对苹果枝条组织中病程相关蛋白基因表达的影响。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。所使用的试剂如无特殊说明，均可商业购买。
36.实验所用的培养基及其配方
37.1、lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 5g，ph调至7.0。
38.2、pda培养基：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000ml，ph值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
39.3、pdb培养基：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，定容至1000ml，ph值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
40.实施例1马胃葡萄球菌f1的分离筛选与菌株鉴定
41.1.菌株的分离与筛选
42.从山东商品化富士苹果园采集成熟健康果实，表面消毒后取果实组织研磨，加入无菌水，采用常规梯度稀释涂布分离法，用pda培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异明显的菌落，在pda培养基上纯化保存，并以苹果树腐烂病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株具有抑菌作用和显著防治效果的细菌菌株，命名为f1。
43.2.菌株f1的鉴定
44.(1)形态特征
45.如图1结果所示，菌株f1在lb培养基上菌落小，呈灰白色，突起呈圆形(略不规则)，不透明，表面湿润光滑，鉴定该菌体为革兰氏阳性菌。
46.(2)生理生化特性
47.菌株f1可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇等作为碳源，不能利用半乳糖、乳糖等作为碳源；过氧化氢酶、v-p、甲基红和脲酶反应阳性，能液化明教，水解淀粉，不形成菌膜，上述特性与马胃葡萄球菌相符。
48.(3)基因序列鉴定：
49.a、实验方法：利用试剂盒提取菌株f1的基因组dna，将其作为dna模板，再采用通用
引物primer f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，primer r：5
’‑
aaggaggtgatccagccgca-3’对dna模板进行pcr扩增。
50.pcr扩增反应体系(50μl)：dna模板2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taq酶(takara)1μl，dntp 1μl，2
×
taq buffer 25μl，ddh2o 17μl。pcr扩增程序：95℃预变性5min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸2min，进行35个循环，72℃延伸10min。将扩增产物(5μl)通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。pcr扩增结果如图2所示，将pcr扩增产物回收后送交上海生物工程有限公司进行序列测定。
51.b、结果及分析：测定结果表明，16s rdna序列扩增片段长度为1431bp，其序列如序列表seq id no:1所示。将所得序列采用ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的blast软件与genbank中的核酸序列进行比对，与马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)c4044菌株和c2060菌株(accession no：kf439736和kf439734)的16s rdna序列同源性为99.9％。
52.基于以上前述的形态学特征、生理生化特性及序列分析的结果，将菌株f1鉴定为马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)。
53.实施例2马胃葡萄球菌菌株f1对多种植物病原菌的抑制作用
54.a、实验方法：制备马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)f1菌悬液，使其终浓度为109cfu
·
ml-1
，以不添加菌株f1的pda作为对照，后接种活化培养的各病原菌。
55.抑菌率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％。
56.b、结果及分析：如表1的结果显示，菌株f1对果蔬灰霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽叶枯病菌等主要植物病原菌都具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，其培养4d时抑菌率见表1。
57.表1马胃葡萄球菌(staphylococcus equorum)菌株f1对主要植物病原菌的抑制作用
[0058][0059]
实施例3马胃葡萄球菌f1对苹果树腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发的影响
[0060]
(1)菌株f1对腐烂病菌菌丝生长的影响
[0061]
a、实验方法：
[0062]
配置pda培养基，制作平板，将f1菌株在平板一侧距离中心约2cm处划线接种，于28℃培养2d后，在另一侧相对位置接种活化好的苹果树腐烂病菌，以不接种f1菌株仅接种腐烂病菌的平板作对照，于28℃恒温暗培养3d，测量菌落直径。
[0063]
b、结果及分析：
[0064]
图3a结果表明，菌株f1可明显抑制腐烂病菌菌丝的生长，培养3d后，对照菌落直径平均为8.8cm，对峙培养皿内菌落直径为4.7cm，抑菌率为46.6％。
[0065]
(2)菌株f1对腐烂病菌孢子萌发的影响
[0066]
a、实验方法：
[0067]
制备腐烂病菌的孢子悬浮液，将病原菌在pda平板上暗培养，待菌丝长满平皿时，置于黑光灯下(365nm)诱导，约2周后可见黑色分生孢子器产生并释放出黄色分生孢子角，配置分生孢子悬浮液调节浓度至106个
·
ml-1
。
[0068]
将菌株f1的种子发酵液接种于pdb培养基中，28℃恒温震荡培养48h，得到f1菌株的细胞培养液，并将浓度调节为109cfu
·
ml-1
，离心过滤后得到f1菌株上清液，菌体用无菌水重新悬浮，制备成不同浓度菌悬液109cfu
·
ml-1
，107cfu
·
ml-1
和105cfu
·
ml-1
。将f1菌株各浓度菌悬液和上清液分别与等体积的腐烂病菌分生孢子悬浮液106个
·
ml-1
混合，置于25℃黑暗条件下，12h后观察腐烂病菌孢子萌发率。
[0069]
b、结果及分析：
[0070]
如图3b结果显示，对照组(ck)的腐烂病菌分生孢子萌发率为80.25％,f1菌株不同处理均对腐烂病菌分生孢子萌发有显著抑制作用，其中浓度为109cfu
·
ml-1
的f1菌体抑制效果最显著，孢子萌发率仅为3.25％，抑制率高达95.95％；f1上清液处理后的孢子萌发率为12.13％，f1上清液对腐烂病菌孢子萌发的抑制率为84.89％。
[0071]
实施例4马胃葡萄球菌f1的发酵上清液对苹果树腐烂病的防治效果
[0072]
1、实验方法：
[0073]
将菌株f1的种子发酵液接种于pdb培养基中，28℃恒温震荡培养48h，得到f1菌株的细胞培养液，并将浓度调节为109cfu
·
ml-1
，离心过滤后得到f1菌株上清液。腐烂病菌在pda上活化培养3d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼备用。
[0074]
选取长势一致的1-2年生健康富士枝条，用电烙铁烫伤，伤口长约3mm，深1mm，每伤口接种20μl菌株f1上清液，室温晾干后枝条置于25℃，相对湿度90％培养箱中，间隔48h后接种上述已活化的腐烂病菌菌饼，以接种pdb培养基再接种腐烂病菌的处理作为对照。接种后4d观察并测量病斑长度。
[0075]
防治效果＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径
×
100％
[0076]
2、实验结果及分析
[0077]
如图4所示，对照组枝条接种腐烂病菌后病斑快速扩展，4d时病斑长度平均为4.38cm，而接种菌株f1上清液的处理组中，病斑扩展缓慢，病斑长度仅1.52cm，其防治效果为65.3％。
[0078]
实施例5苹果树腐烂病生防菌剂的制备
[0079]
本实施例提供一种采用菌株f1制备的苹果树腐烂病生防菌剂，其制备方法具体包括以下步骤：
[0080]
(1)将菌株f1划线接种在pda培养基中，于28℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株f1单菌落a；
[0081]
(2)将所述活化的菌株f1单菌落a，接种于装瓶量80ml/250ml的pdb培养基中，180r
·
min-1
，28℃恒温震荡培养12h，得到菌株f1发酵种子液b；
[0082]
(3)将所述发酵种子液b按1:100的接种量接种到pdb培养基中扩大培养，28℃恒温震荡培养48h，得到109cfu
·
ml-1
f1菌株的细胞培养液c；
[0083]
(4)将109cfu
·
ml-1
f1菌株的细胞培养液c，在4℃条件下，12000r
·
min-1
离心
15min，菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到109cfu
·
ml-1
的菌悬液，即为生防菌剂。
[0084]
需要说明的是，所述109cfu
·
ml-1
的菌悬液在使用的时候，一般要稀释0-10000倍。
[0085]
实施例5马胃葡萄球菌f1不同浓度菌悬液对苹果树腐烂病的防治效果
[0086]
1、实验方法：
[0087]
制备菌株f1不同浓度菌悬液，107cfu
·
ml-1
，108cfu
·
ml-1
和109cfu
·
ml-1
。选取长势一致的1-2年生健康富士枝条，用电烙铁烫伤，伤口长约3mm，深1mm，每伤口接种20μl菌株f1菌悬液105cfu
·
ml-1
，107cfu
·
ml-1
和109cfu
·
ml-1
，室温晾干后枝条置于25℃，相对湿度90％培养箱中，间隔48h后接种活化的腐烂病菌菌饼，以接种pdb培养基再接种腐烂病菌的处理作为对照。接种后5d观察并测量病斑长度，统计病斑直径，计算防治效果。
[0088]
防治效果＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径
×
100％。
[0089]
2、实验结果及分析
[0090]
如表2结果的结果显示，不同浓度的f1菌悬液防治效果均达65％以上。其中，109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液的防治效果最高，达到75％以上。
[0091]
表2菌株f1不同浓度菌悬液对苹果树腐烂病菌的防治效果
[0092][0093][0094]
实施例6马胃葡萄球菌f1菌悬液对苹果组织中防御相关酶活性的影响
[0095]
1、实验方法：
[0096]
按照实施例4的方法选择健康富士苹果枝条，均匀喷施109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液，以无菌水处理的枝条作为对照。分别于处理后0、12、24、48、72、120h取枝条韧皮部组织，测定苹果枝条组织中防御相关酶活性的变化趋势。其中，pod(过氧化物酶)和sod(超氧化物歧化酶)活性测定分别采用愈创木酚法和黄嘌呤氧化酶法；pal(苯丙氨酸解胺酶)和ppo(多酚氧化酶)活性测定分别采用苯丙氨酸法和邻苯二酚法。
[0097]
2、实验结果及分析
[0098]
结果如图5所示，109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液处理苹果枝条后，枝条组织中过氧化物酶(pod)、超氧化歧化酶(sod)、苯丙氨酸解胺酶(pal)和多酚氧化酶(ppo)活性相比对照均得到不同程度的显著提高，这说明马胃葡萄球菌f1可通过提高枝条中防御相关酶活性从而诱导苹果枝条对病害的抗性。
[0099]
实施例7马胃葡萄球菌f1菌悬液对苹果组织中病程相关蛋白基因表达的影响
[0100]
1、实验方法：
[0101]
按照实施例4的方法选择健康富士苹果枝条，均匀喷施109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液，以无菌水处理的枝条作为对照。分别于处理后0、24、48h取枝条韧皮部组织，提取样品总rna后进行反转录，利用rt-qpcr技术测定苹果枝条组织中病程相关蛋白基因的表达情况。
[0102]
2、实验结果及分析
[0103]
结果如图6所示，浓度为109cfu
·
ml-1
的f1菌悬液处理苹果枝条后，枝条组织中病程相关蛋白基因mdpr1和mdpr5表达量相比对照均显著升高，处理后48h mdpr1和mdpr5的表达量均最高，先比对照分别提高了8.33倍和16.32倍，这说明马胃葡萄球菌f1可诱导苹果枝条中病程相关蛋白基因上调表达，从而提高苹果枝条对病害的抗性。
[0104]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。