植物抗病原体系统的制作方法
【专利说明】植物抗病原体系统
[0001] 本申请是申请号为200980132913. 6、申请日为2009年8月4日、发明名称为"植 物抗病原体系统"的中国发明专利申请的分案申请。
[000引提交数据
[0003] 本申请涉及且要求于2008年8月5日提交的美国专利申请号61/086, 444的优先 权，所述专利的完整内容通过引用合并入本文。
[0004] 领域
[0005] 总的来说，本发明涉及植物不受植物病原体且特别是不受真菌病原体的保护。本 发明特别提供了抑制植物中的病原体感染且改善对敏感植物的损害的多价方法。
[000引背景
[0007] 在本说明书中由作者参考的出版物的书目细节在说明书结束时按字母顺序收集。
[0008] 在本说明书中提及任何现有技术并非且不应视为承认或W任何形式暗示该个现 有技术构成任何国家中的共有一般知识的部分。
[0009] 由于通过植物病原体例如真菌病原体的感染的农作物损失是农业生产中的主 要问题，并且每年在杀真菌剂应用上花费数百万美元W制止该些损失（Oerke和Dehne， 2004)。需要鉴定用于处理通过病原体例如真菌感染的新抗微生物剂和策略。考虑到病原 体发展抗性的倾向，该是特别重要的。
[0010] 已进化出抗微生物肤W保护生物体不受病原体。它们的特异性在很大程度上依赖 于它们源于其的生物体，可能是由于由各种病原体置于该些生物体的进化压力。像该样，与 真菌病原体相比较，从哺乳动物物种中分离出的肤一般显示出针对细菌病原体更高程度 的活性，推测是由于来自细菌感染的更高风险。相比之下，由于由植物面对的真菌感染的更 高风险，植物抗微生物肤一般显示出更高的抗真菌活性。
[0011] 植物防御素代表一类抗微生物肤（由Lay和Anderson, 2005综述）。存在具有不 同空间和时间表达模式和活性谱的广泛多样的防御素。
[0012] 该些肤的特异性的潜在机制仍是未知的，尽管推测涉及与质膜组分的相互作用。 因为膜透化是许多抗微生物肤的共同活性，并且各种细胞类型的膜组成是高度可变的，所 W特异性脂质的存在推测在某些情况下负责抗微生物肤的功效。特别地，细菌细胞的质膜 在外层中包含带负电荷的磯脂，而哺乳动物细胞则不是（Matsuzaki，1999)。该些带负电 荷的脂质可W与带正电荷的抗微生物肤相互作用。为支持该个假设，体外研究已证实带负 电荷的脂质的存在对于许多抗微生物肤的膜透化活性是重要的（Matsuzaki等人，1995 ; Matsuzaki, 1999 ;E；pand 等人，2006)。
[0013] 膜透化已暗示为关于某些植物防御素的作用机制，尽管透化机制仍未得到研究。 在植物防御素RSAFP2和DmAMPl的情况下，提出透化涉及在细胞表面上的特定受体。在质膜 中特异性銷脂的存在也是该些防御素的活性所需的，可能作为结合位点（Thevissen等人， 2000 ;Thevissen 等人，2004 ;Thevissen 等人，2005 ;Ramamoo;rthy 等人，2007)。
[0014] 植物病原体诱导显著的植物产量损失，并且目前用于病原体控制的策略是昂贵的 且对环境潜在性损害的。考虑到改善农业生产经济的需要，需要新策略用于保护农业和观 赏上重要的植物不受一系列疾病，特别是真菌病。
[00巧]概述
[0016] 本文公开的是用于减少经由病原体例如真菌因子引起的对农作物和观赏植物的 损害的系统。传统控制方法涉及化学杀真菌剂的应用。该增加了农作物和花生产的成本。 依照本发明，鉴定了在植物防御素和蛋白酶抑制剂之间令人梅讶的协同作用，导致预防和 改善植物中的疾病状况的功效增加。
[0017] 因此，本发明提供了用于保护植物不受与经由病原体感染相关的疾病的系统，该 系统包括给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体或功能同系 物、类似物、衍生物或其变体。在一个特定实施方案中，植物病原体是真菌。提及"植物"在 一个方面包括植物及其后代。
[0018] 因此，本发明尤其提供了用于保护植物不受经由真菌病原体感染和/或用于减少 真菌病原体相关疾病的严重度发生率的系统。该系统包括使用至少一种防御素和一种蛋白 酶抑制剂的组合的多价方法。出乎意料地，给定防御素和给定蛋白酶抑制剂对给定真菌病 原体的组合作用是协同的，即当它们在植物环境中组合时（至少）2种组分的抗病原体活性 大于蛋白酶抑制剂或防御素单独作用的抑制效应的总和。
[0019] 因此，本发明进一步提供了用于保护植物不受与经由病原体感染相关的疾病的系 统，该系统包括W协同有效量给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者 的前体或功能同系物、类似物、衍生物或其变体，W减少经由病原体的感染。
[0020] 提及"系统"包括植物管理系统、方案和方法。如上所述，在一个特定实施方案中， 病原体是真菌病原体。
[0021] 提及"提供植物的细胞"包括从外源来源提供防御素和蛋白酶抑制剂，或从细胞内 提供两者或一种外源提供和一种细胞内提供。
[0022] 本发明进一步考虑了植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体形式在制 造遗传修饰植物中的用途，所述遗传修饰植物对真菌感染较不敏感或显示出更少的真菌感 染相关损害。
[0023] 在一个实施方案中，存在用于保护农作物或观赏植物不受真菌病的系统，其包括 给植物提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或其功能同系物、类似物或变体或等价物。在该个 实施方案中，与每种组分单独的组合分开效应相比较，由2种组分的真菌抑制程度被视为 协同的。在一个实施方案中，存在通过至少一种植物防御素例如NaDl或其抗真菌变体和 各种蛋白酶抑制剂中的至少一种的组合对镶刀菌属（化sarium)物种的协同抑制，所述蛋 白酶抑制剂包括但不限于来自植物的半脫氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂例如 StPinlA(如美国专利号7, 462, 695中所述W前称为化tlA的马铃墓I型抑制剂）或牛膜蛋 白酶抑制剂I-P。对通过系统组分各自抑制分别敏感的任何真菌通过使用组合比单独使用 任一组分可W更有效地得到控制。
[0024] 本发明进一步提供了用于保护植物不受与经由真菌病原体感染相关的疾病的系 统。该系统包括给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体或功能 同系物、类似物、衍生物或其变体。
[0025] 本发明的多价方法包括包括协同作用的植物防御素和蛋白酶抑制剂。该些组分可 W通过重组方法在植物细胞内产生且任选从植物细胞输出或输入到植物细胞内。备选地， 组分可w局部地提供给植物细胞，例如w喷雾剂、气溶胶、粉剂的形式或作为服料或植物食 物的部分。如上所述，在另外一个备选方案中，防御素或蛋白酶抑制剂之一通过重组方法提 供，并且该些组分的另一种外源提供。
[0026] 本发明的另一个方面考虑了用于抑制真菌生长、复制、感染和/或维持的方法，该 方法包括使真菌暴露于植物防御素和蛋白酶抑制剂的组合。
[0027] 再次，与由任一组分W用于组合暴露的相同剂量与真菌单独接触提供的抑制总和 相比较，在防御素和蛋白酶抑制剂的存在下的真菌抑制程度是协同的。
[0028] 如果可W显示每种组分单独地发挥针对真菌的抑制活性，或组合中的组分发挥协 同的组合抑制效应，那么真菌对经由系统的个体组分各自"的抑制是敏感的"。
[0029] 本发明延伸至系统组分对真菌细胞透性的作用的测量。采用可W鉴定其定位的物 质，无论是在真菌细胞内部还是外部。该物质在本文中特别被称为"透性指示剂化合物"。 透性指示剂化合物是其在细胞内部或外部的存在可W依靠具有可检测性质进行可检测测 量的化合物，所述可检测性质例如英光、放射性标记、免疫学特征等。此外，透性指示剂化合 物是该样的化合物，其在正常条件下保持在细胞外，并且除非细胞透性已从细胞的正常生 理条件改变，否则将无法在细胞内检测出。原则上，透性的指示剂还可W是正常保留在细胞 内，仅在异常条件下渗漏出去的化合物，但前面一种类型的指示剂更常见。可W用于监控从 细胞外到细胞内环境的移动的透性指示剂化合物的例子包括与核酸结合的英光染料例如 SYT0X⑩Green,或楓化丙巧。其他例子包括FITC标记的右旋糖酢或免疫金标记的抗体， 其定位可W通过显微镜检查进行检测。英光标记的防御素其自身也可W用作透性指示剂化 合物。从细胞内环境释放到细胞外环境的ATP的测量（如通过引用合并入本文的美国专利 申请号US12/362, 657中公开的）也可W用作透性的指示剂。术语"可检测的量"意欲传达 透性指示剂化合物的量方面的差异可W半定量地进行评估，足W用于比较目的。为了比较 植物防御素对真菌细胞透性的可能作用的目的，使用植物防御素NaDl作为用于比较的基 础。
[0030] 本发明的实施方案包括其中防御素是具有针对至少一种致病性真菌的杀真菌和/ 或抑制真菌活性的任何防御素的那些。此类抗真菌防御素的例子包括但不限于来自萝h的 NaDl、化D1A、化02、Tomdef2、RsAFP2、RsAFPl、RsAFP3 和 RsAFP4,来自大丽花（d址lia)的 DmAMPl,来自走叶树（Aesculus hippocatanum)的 MsDefl、MtDef2、CtAMPl、PsDl、HsAFPl、 VaDl、化D2、ZmESR6、AMMPl 和 AMMP4,来自首荐（alfalfa)的 AflAFP，来自魏豆的 NaD2、 八乂1、4《2、8501、66401、狀41?1、11-2、？曲1、502、5〇02、胖1'1、9139和91230。嵌合防御素分 子和/或保留抗真菌活性的防御素变体也可W用于本发明的系统中W用于植物保护。
[0031] 嵌合防御素分子和/或保留抗真菌活性的防御素变体也可W用于本发明的系统 中W用于