一种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术领域的一种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基及其方法。
【背景技术】
[0002]植物花药培养技术在作物遗传育种理论和实践研究中具有广阔的应用前景，通过花药培养可快速有效的获得纯合双单倍体，避免了通过传统育种手段需要多代自交才可以获得纯合稳定的品系，从而大大缩短了育种周期，提高了选择效率，降低成本。此外，通过花药培养获得的双单倍体可直接用于遗传图谱的构建、培育新品种或作为优良亲本用于品种改良。利用花药培养诱导单倍体或双单倍体已在很多植物上有成功的报道，同时利用获得的新种质资源已进行了新品种的选育和推广，并取得了良好的社会和经济效益。
[0003]随着植物花药培养技术的发展，为茄子新品种的选育开辟了一条新途径。利用茄子花药可快速获得纯系和突变体，创新种质资源，对茄子的品种改良具有重要的意义。目前茄子花药培养在实际育种中的应用的不足有愈伤组织诱导率较低，再生植株分化率低，单倍体植株的加倍率低，培养周期长等。因此，如何提高茄子花药培养中愈伤组织的诱导率和愈伤组织分化植株的分化率及单倍体植株的加倍率是茄子花药培养技术研究中急需解决的一个难题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有花药培养技术中愈伤组织诱导率低的不足，愈伤组织分化植株分化率低的不足及单倍体植株加倍率低的不足，给出一种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基及其方法，通过这种方法可快速诱导茄子花药形成愈伤组织，提高愈伤组织的诱导分化率和单倍体植株的加倍率，从而丰富适宜的茄子花药培养条件，为建立高效的茄子花药培养植株再生体系奠定基础。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基，其特征在于:所述培养基包括茄子花药培养愈伤组织诱导培养基和愈伤组织分化培养基，所述茄子花药培养愈伤组织诱导培养基为:MS 基本培养基，0.2-0.5mg/L 2，4-D，0.5-lmg/L KT, 5-lOmg/L Vc, 3% 蔗糖，5g/L 琼脂，PH值5.8 ;所述愈伤组织分化培养基为:MS基本培养基，0.01-0.05mg/L IAA, 1.0-2.0mg/L6-BA，0.1-0.5g/L 活性炭，2% 蔗糖，5.5g/L 琼脂，PH 值 5.8。
[0006]所述茄子花药培养愈伤组织诱导培养基为:MS基本培养基，0.2mg/L 2，4-D，0.9mg/L KT, I Omg/L Vc, 3%蔗糖，5g/L琼脂，PH值5.8 ;所述愈伤组织分化培养基为:MS基本培养基，0.02mg/L IAA, 2.0mg/L 6-BA, 0.5g/L 活性炭，2% 蔗糖，5.5g/L 琼脂，PH 值 5.8。
[0007]所述茄子花药的培养包括如下步骤:
O从爺子植株上生长对爺或四门斗爺的位置上选取花蕾，花蕾中花药细胞处于单核中期至单核靠边期，花蕾直径7-10mm，花药为黄绿色偏绿； 2)预处理:将采集回来的花蕾用防水袋或培养瓶封闭，置于4-5°C冷藏室保存12-24
h ；
3)灭菌:先用70%或者75%的酒精进行花蕾表面消毒30s，再用次氯酸钠原液的体积浓度为7%溶液浸泡15-20min，其中次氯酸钠原液中次氯酸钠的质量浓度为10%，之后用无菌水洗涤3-4次，每次3min，然后用无菌纸吸干花蕾备用；
4)接种:在无菌工作台上从灭完菌的花蕾中轻轻剥取花药，接种于装有茄子花药培养愈伤组织诱导培养基的Φ 60mm培养皿中，每个培养皿装有1mL培养基，每个培养皿接1_2个花蕾的花药；
5)热激处理:将接种好花药的培养皿放到培养箱内进行热激处理，黑暗培养，热激温度为35?40°C，处理4?9d ；
6)花药培养:经高温热激处理后的花药，放置在25-28°C，光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d下培养，每隔15-20 d转接次，30-40d出现愈伤组织；
7)愈伤组织再生植株:当花药中部或顶部愈伤组织块长到直径约10_，将愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，每隔15-20 d切割继代一次，30-35 d愈伤组织上开始分化出绿色芽点，继代培养条件:光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d，温度为25_28°C，经过继代培养，45%-55%的愈伤组织分化为成熟的胚状体直接生成根茎叶具全的完整小植株；
8)再生植株诱导生根:8%-12%的愈伤组织直接分化出无根的再生芽，当芽苗长到2-3cm时，切下带部分愈伤组织的小苗，转接到MS培养基中，在光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d，温度为25-28°C生根培养条件下，10_15d后长出不定根，生成完整植株，生根率为 90% ；
9)倍性检测:采用根尖生长点染色体倍数检测方法，在无菌工作台中从培养瓶中剪取生根再生苗的幼嫩根尖进行检测；
10)单倍体植株加倍:将步骤9检测所得单倍体植株采用生长点浸泡法，移栽后在傍晚剥去单倍体植株的生长点外部幼叶，使生长锥外漏，用脱脂棉蘸取0.3-1.0%秋水仙碱+1.5%DMSO溶液包裹生长锥，外边再用黑色塑料膜包裹，处理f3h，可得二倍体正常茄子雌雄花，加倍率达60%，此方法能在茄子生长的不同时期进行，打破了秋水仙素加倍处理只能在苗期进行的局限。
[0008]所述步骤(5)中，将接种好花药的培养皿放到培养箱内进行热激处理，黑暗培养，热激温度为36 °C，处理5 d。
[0009]所述步骤(10)中，用脱脂棉蘸取0.5 %秋水仙碱+1.5%DMS0溶液包裹生长锥，夕卜边再用黑色塑料膜包裹。
[0010]与现有技术相比，本发明在基本培养基中添加适量的VC和活性炭及使用IAA，具有愈伤组织的诱导率高，愈伤组织分化效率高，培养效果好，不易褐化等优点，愈伤组织培养时间长，可继代培养2年，从培养的愈伤组织中不断诱导再生植株。愈伤组织的诱导率最高可达90%，植株再生率最高达到47%，单倍体率可达60%，适宜浓度和方法的秋水仙素处理使单倍体的加倍率高达60%;将本发明花药培养方法应用于茄子遗传育种中，可以大大提高茄子花药培养再生植株的诱导率，丰富茄子优良基因型个体，完善茄子单倍体育种途径，缩短育种周期，为加快茄子遗传育种和茄科植物花药离体培养研究提供技术和理论依据。
【附图说明】
[0011]图1是本发明的一个实施例刚接种的花药示意图图2是本发明的一个实施例膨大的花药示意图
图3是本发明的一个实施例产生愈伤组织的花药示意图图4是本发明的一个实施例愈伤组织分化出茄子芽苗的示意图图5是本发明的一个实施例根叶芽俱全的再生植株示意图图6是本发明的一个实施例再生苗移栽示意图图7是本发明的一个实施例秋水仙素诱导示意图。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:一种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基及其方法，其步骤如下:
O从爺子植株上生长对爺或四门斗爺的位置上选取花蕾，花蕾中花药细胞处于单核中期至单核靠边期，花蕾直径10mm，花药为黄绿色偏绿；
2)预处理:将采集回来的花蕾用防水袋或培养瓶封闭，置于4-5°C冷藏室保存24h ；
3)灭菌:先用75%的酒精进行花蕾表面消毒30s，再用质量浓度为7%次氯酸钠原液溶液浸泡20min，其中次氯酸钠原液中次氯酸钠的质量浓度为10%，之后用无菌水洗涤4次，每次3min，然后用无菌纸吸干花蕾备用；
4)接种:在无菌工作台上从灭完菌的花蕾中轻轻剥取花药，接种于装有茄子花药培养愈伤组织的诱导培养基的Φ60πιπι培养皿中，每个培养皿装有1mL培养基，每个培养皿接1-2个花蕾的花药；
5)热激处理:将接种好花药的培养皿放到培养箱内进行热激处理，黑暗培养，热激温度为36°C，处理5d;
6)花药培养:经高温热激处理后的花药，放置在25-28°C，光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d下培养，视培养基情况，每隔20d转接培养基一次，35d左右会出现愈伤组织；
7)愈伤组织再生植株:当花药中部或顶部愈伤组织块长到直径约10_，将愈伤组织转化到愈伤组织分化培养基上，每间隔15-20 d切割继代一次，30-40 d愈伤组织上开始分化出绿色芽点，继代培养条件:光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d，温度为25_28°C，经过继代培养，50%左右的愈伤组织分化为成熟的胚状体直接生成根茎叶具全的完整小植株；
8)再生植株诱导生根:10%左右的愈伤组织直接分化出无根的再生芽，当芽苗长到3cm时，切下带部分愈伤组织的小苗，转接到MS培养基中，在光照强度1500-2000LX、光照12-16h/d，温度为25-28°C生根培养条件下，15d后，有不定根出现；
9)倍性检测:采用根尖生长点染色体倍数检测方法，在无菌工作台中从培养瓶中剪取生根再生苗的幼嫩根尖进行检测；
10)单倍体植株加倍:将步骤9检测所得单倍体植株采用生长点浸泡法加倍，移栽后在傍晚剥去单倍体植株的生长点外部幼叶，使生长锥外漏，用脱脂棉蘸取0.5%秋水仙碱+1.5%DMS0溶液，包裹生长锥，外边再用黑色塑料膜包裹，处理2h，可得二倍体正常茄子雌雄花，加倍率达60%。
[0013]所用培养基:
愈伤组织诱导培养基的主要成分为MS基本培养基，2，4-D，KT, Vc，蔗糖和琼脂，其中2，4-D的浓度为0.2mg/L, KT的浓度为0.9mg/L, Vc的浓度为10mg/L,鹿糖的浓度为3%,琼脂的浓度为5g/L，pH值为5.8;
愈伤组织分化培养基的主要成分为:MS基本培养基，IAA，6-BA，活性炭，蔗糖，琼脂，其中IAA的浓度为0.02mg/L, 6-BA的浓度为2.0mg/L,活性炭的浓度为0.5g/L，蔗糖的浓度为2%，琼脂的浓度为5.5g/L，pH值为5.8。
[0014]实施例2:—种茄子花药培养诱导单倍体植株的培养基及其方法，其步骤如下:
O从爺子植株上生长对爺或四门斗爺的位置上选取花蕾，花蕾中花药细胞处于单核中期至单核靠边期，花蕾直径10mm，花药为黄绿色偏绿；
2)预处理:将采集回来的花蕾用防水袋或培养瓶封闭，置于4-5°C冷藏室保存24h ；
3)灭菌:先用75%的酒精进行花蕾表面消毒30s，再用质量浓度为7%次氯酸钠原液溶液浸泡20min，其中次氯酸钠原液中次氯酸钠的质量浓度为10%，之后用无菌水洗涤4次，每次3min，然后用无菌纸吸干花蕾备用；
4)接种:在无菌工作台上从灭完菌的花蕾中轻轻剥取花药，接种于装有茄子花药培养愈伤组织的诱导培养基的Φ60πι