一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种医用动物模型，具体来说，涉及一种实验性高 原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法。
【背景技术】
[0002] 大量的研宄早已证实，当机体遭受重大应激（如创伤、手术、休克等），肠道往往 是最敏感的器官之一，除了应激本身造成的损伤，还容易因为扩大的全身炎症反应承受"二 次打击"，导致肠道毒素和细菌移位，甚至诱发多器官功能衰竭。高原是一个低压性缺氧的 特殊环境，而毫无疑问，急性缺氧对于机体来说也是一种强烈的刺激，急性缺氧对机体各脏 器均有明显损伤。肠道特殊的血流供应及解剖结构使其对缺氧尤为敏感，这也使得肠道在 缺氧应激时成为最易受损的器官之一。根据国内外学者所做的调查，抽样显示急进高海拔 地区的人群胃肠道粘膜均存在不同程度的损伤，作为人体最大的储菌/内毒素库，一旦肠 道屏障功能破坏，大量肠道细菌及内毒素可随血液系统移位至身体其他组织或器官，导 致多种炎症介质"瀑布样"级联效应，诱发全身炎症反应综合征（systemicinflammatory responsesyndrome,SIRS)，甚至多器官功能障碍综合征（multipleorgandysfunction syndrome,MODS)。
[0003] 我国高原面积辽阔，约占国土总面积的1/4,人口近1000万，随着经济的发展，大 批人群进驻高原参与当地的开发建设，使急性高原病的发病率迅速增加，严重威胁了急进 高海拔人们的生命安全。既往对于高原肺水肿和高原脑水肿的关注较多，但关于其机制的 研宄至今仍然存在很多谜团，这也使研宄陷入了瓶颈。随着"胃肠道是MODS的始动器官"这 一学说被越来越多学者所接受，促使人们开始从肠道寻找上述疾病发病机制的新切入点。 加之急进高原后人群胃肠道疾病发病率的上升，也使对急性缺氧导致的胃肠道功能损伤的 研宄迫在眉睫。而针对急性缺氧导致的肠道屏障功能损伤，其涉及的发病机制复杂，至今仍 未解释清楚。作为研宄的基础，动物模型的建立显得尤为重要。当前对于构建胃肠道损伤 动物模型存在多种方法，但基于以下原因，均不符合急性缺氧导致的肠粘膜屏障功能损伤 的病理生理学要求：1、物种原因：选取家兔、猪等实验动物，从遗传学角度讲，与人类遗传 背景差别较大，研宄结果很难类推到人类；2、方法原因：采用手术、创伤、药物等物理及化 学手段，虽然效果可靠，但基于施加有创手段获得的模型，不符合缺氧导致的急性损伤发病 机制；3、实际应用原因：有报道称，将大鼠置于模拟海拔7000m高度，可导致明显胃肠道损 伤，但此种建模方法与实际情况相去甚远，一方面人类生存极限高度为5000m，且90%以上 高原人群生活在海拔3000m-4000m之间，海拔7000m这一极端环境导致的损伤是否和4000m 有所差别，不得而知。另一方面，将动物置于模拟海拔7000m建模结束以后，为保证实验人 员安全，取材时需将模拟舱海拔下降至4000m以下，在这一过程中是否会出现急性缺氧以 后快速复氧导致的再灌注或氧化应激，由此形成二次打击，导致肠粘膜损伤，这与单纯急性 缺氧对肠粘膜的损伤也存在机制上的不同。本申请的发明人前期通过大量的实验证明，在 3000m-5000m海拔单纯急性缺氧，不足以对大鼠肠道造成明显损伤。
[0004] 因此，目前国内外少有符合人体进驻高原后实际生理条件，且稳定可重复的实验 性高原胃肠道损伤动物模型，严重制约了人们对该类疾病发生机制、发展过程的探讨和治 疗效果的评价。寻找一种稳定有效和安全可靠，且符合高原胃肠道损伤发病机理的动物模 型建立方法，显得十分必要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立 方法，该方法可建立稳定的高原肠道屏障损伤大鼠模型，为高原胃肠道损伤机制的进一步 研宄奠定实验基础。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述的建立方法为：在平原 环境下，先将健康大鼠饲养5-7天，然后进行动物跑台适应性训练得到平原适应性大鼠，对 所得的平原适应性大鼠给予运动负荷进行平原干预训练，使所述的平原适应性大鼠达到疲 劳应激状态，然后将达到疲劳应激状态的大鼠置于高原低压缺氧模拟环境中连续饲养即得 到实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型。
[0008] 本申请的发明人在前期通过大量的预实验证明，在3000m-5000m海拔单纯急性缺 氧，不足以对大鼠肠道造成明显损伤。在本发明中，大鼠先在平原环境中进行跑台适应性训 练和平原干预训练，然后在高原低压缺氧模拟环境中进行饲养，即采取高原环境模拟给予 较低海拔，同时外加负荷运动的手段建立急性缺氧后肠道屏障损伤的动物模型。本实验中， 我们首先将动物饲养于平原，使其充分适应环境，同时让其在动物跑步机上适应性训练，避 免正式实验开始后由于动物不熟悉器械导致的配合困难。然后在平原环境给予一个运动负 荷，该运动负荷只能使大鼠达到轻度的疲劳应激（发明人通过前期预实验表明，大鼠在平 原环境，传送带坡度为10°，转速15m/min，连续运动4小时，中间休息30min的模式下，连 续运动5天方能达到力竭），并不会引起大鼠肠道相关的病理生理学改变。更为重要的是， 对大鼠前期施加的运动负荷，与大多数人群采取铁路或者公路交通抵达高原所承受的疲劳 状态相当，使模型的建立更具有对比性。平原训练（包括跑台适应性训练和平原干预训练） 结束之后，将大鼠置于高原低压缺氧模拟环境中，精确控制温度、湿度、明暗周期环境因素， 定量饮食，控制非实验因素造成组间实验结果的差异。
[0009] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，于平原环境 下饲养5-7天，不限制食水，自然光照，使其充分适应环境。
[0010] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，饲养5-7天 后，然后进行动物跑台适应性训练，所述动物跑台适应性训练为：调整传送带坡度为0°， 转速8m/min，时间30min，之后休息30min，休息期间可自由进食水，以此方法重复训练8次， 训练时间共计240min，动物跑台适应性训练当天自然昼夜照明。进行动物跑台适应性训练， 避免正式实验开始后由于动物不熟悉器械导致的配合困难。
[0011] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述动物跑 台适应性训练结束后的第二天，再对所得的平原适应性大鼠给予运动负荷进行平原干预训 练。
[0012] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，对所得的平 原适应性大鼠给予运动负荷进行平原干预训练，优选的，所述的平原干预训练具体为：将所 述平原适应性大鼠置于跑步机上，设置初始传送带坡度为0°，转速8m/min，时间15min，随 后调整传送带坡度为10°，转速15m/min，连续运动4小时，之后休息30min，休息期间可自 由进食水，休息结束之后，再次重复上述训练模式，所述平原干预性训练共计24小时。
[0013] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述的平原 干预训练过程中，对停止在运行传送带上的大鼠给予适当电刺激使其维持被动运动状态。
[0014] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述的高原 低压缺氧模拟环境为：海拔高度4000m，舱内压力：40.4kPa，风量：40m3/h，温度：25°C，湿 度：60%，02含量：18. 0%，氧分压：7. 8kPa，上升速率：3m/s，光暗周期24h，光12h，暗12h。 本发明中，优选的，设置海拔为4000m，利用高原模拟舱自带的环境模拟系统，精确控制温 度、湿度、明暗周期环境因素，控制非实验因素造成组间实验结果的差异。4000m的高度设 定，更加符合人群在高原环境的实际居住海拔。给予急性缺氧三天后，实验人员在4000m海 拔直接取材，既保证了实验人员的安全，也进一步避免了降低海拔高度取材对大鼠造成的 二次损伤，使模型的建立与实际情况更加的匹配。
[0015] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，将达到疲劳 应激状态的大鼠置于高原低压缺氧模拟环境中连续饲养72h，按每只大鼠25g/d给予鼠粮 饲喂，自由饮水。定量饮食，控制非实验因素造成组间实验结果的差异。
[0016] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述健康大 鼠为健康雄性Sprague-Dawley大鼠。
[0017] 进一步，所述的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，所述平原干 预训练结束后，立即将达到疲劳应激状态的大鼠置于高原低压缺氧模拟环境中连续饲养。
[0018] 本发明的一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法，可以有效的建立较 为符合机体在缺氧环境下胃肠道损伤发病过程的实验动物模型，其机制十分接近机体在自 然状态下疾病的病理生理过程，可为后续实验提供基础，也使进一步研宄成为可能。
【附图说明】
[0019] 图1两组大鼠血清LPS浓度变化（其中*表示与C组比较，p〈0. 01)。
[0020] 图2两组大鼠肠道HE染色（X400)(其中A:C组大鼠肠道粘膜光滑，绒毛排列整 齐，上皮结构完整，上皮细胞间可见均匀分布的杯状细胞；B:H组上皮粘膜层变薄，绒毛减 少，排列紊乱，毛细血管外可见炎细胞浸润及红细胞渗出）。
[0021] 图3两组大鼠肠上皮扫描电镜（其中A:肠绒毛表面光滑、排列整齐、形态饱满；B: 微绒毛变短，部分萎缩、脱落，间隙增宽）。
[0022] 图4两组大鼠肠上皮透射电镜（其中A:毛细血管腔面及微绒毛表面附着高密度 La3+颗粒，上皮细胞间紧密连接关闭，基底膜、毛细血管外间质未见镧颗粒沉积；B:上皮细 胞胞浆完整，胞内内质网、线粒体等细胞器形态结构正常；C:上皮细胞紧密连接开放，可见 镧颗粒渗透入增宽的紧密连接；D