一种海菜花种苗组培快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种含高蛋白的水生植物海菜花种苗组培快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]海菜花Ottelia ac應i/?aia(Gagnep.)Dandy是一种多年生大型沉水植物，我国特有种，国家二级保护植物。海菜花能大量吸收水中的营养物质，减少氮、磷含量，还可分泌一些化感物质抑制藻类生长，因此在解决水体富营养化及水华爆发等生态问题中具有重要作用，被誉为净化水质的“试金石”。海菜花含有丰富的蛋白质、钙、磷等多种营养成分，是一种非常受欢迎的绿色蔬菜，同时也是产区人们发展养殖业的主要饲料来源。此外，海菜花花期长、观赏性好，还能形成“花一鱼一鸟”的独特立体生态景观，具有良好的开发应用前景。
[0003]然而，在自然条件下由于水流、底质及动物取食等原因，萌发的海菜花种子幼苗很难成活；再加上其雌雄佛焰苞及花茎大多被采摘食用，又进一步减少了种子数量。而分株繁殖时，I株成年植株每年也只能分殖3?5株苗，繁殖系数相当低，而且海菜花的茎极度短缩，植株成丛生状，分株时容易受伤并难以成活。近年来由于湿地破坏及人类过渡采挖等因素的影响，海菜花种群数量急剧减少，已处于濒危状态，严重制约了海菜花的应用。可见，与其它沉水植被一样，海菜花的种苗快速规模化繁殖正是困扰其植被恢复，以及开发利用的关键所在。
[0004]植物组织培养技术在种苗繁育中得到广泛应用，技术也相对成熟。利用组织培养技术繁殖海菜花，可在短期内获得大量优良种苗，为海菜花种质资源的保护及开发利用提供技术支撑，具有良好的应用前景。目前，针对海菜花的研宄多集中于生物学、生态学及分类学领域，而对于海菜花种苗组织培养技术的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用植物组织培养技术快速获得大量海菜花种苗的繁殖方法，具有繁殖速度快、种苗质量好、可操作性强等特点，并克服了水生植物组织培养中外植体消毒灭菌困难的问题。
[0006]本发明以蛋白含量高、观赏性好并具有水质净化功能的大型沉水植物海菜花为材料，利用植物组织培养技术进行种苗快速繁殖研宄，通过果实处理及消毒灭菌、种子萌发诱导培养、芽继代增殖培养、生根诱导及试管苗移栽研宄，获得海菜花种苗快速繁殖的方法，从而实现了本发明的目的。
[0007]本发明一种海菜花种苗组培快速繁殖方法，包括以下步骤:
(I)从野外采集朔果充分膨大、果皮呈深蓝色或浅黄色、无病虫的完整海菜花果实，去除果皮表面附着物，并用洗洁精擦洗干净，后用100?200 mg/L的甲基托布津溶液浸泡0.3?lh，自来水冲洗干净；在超净工作台上先用70?75%(v/v)酒精浸泡I?2 min，再用浓度为0.1?0.2%(w/v)升汞浸泡15?20 min，无菌水冲洗5?6遍，获得无菌果实； (2)将步骤(I)获得的无菌果实用手术刀纵向切开，将种子接到萌发培养基中培养形成幼芽；
(3)以步骤(2)获得的无菌幼芽为材料，去除胚根和叶片后，转接到继代增殖培养基中进行增殖培养，获得丛生芽；
(4)经过增殖扩繁后，将植株高度达到4cm的小苗转接到生根培养基上进行生根培养，获得完整试管苗；
(5)将完整试管苗直接在水质良好的水域中进行移栽定植；
其中，所述萌发培养基为:MS、6-BA 0.5?2.0 mg/L,NAA 0.1?0.5 mg/L、琼脂4.5?
6.0 g/L、鹿糖 30 g/L，pH 为 5.8 ?6.2 ;
所述继代增殖培养基为:改良MS、6-BA 1.0?2.0 mg/L, KT 0.5?1.0 mg/L, NAA0.1?0.5 mg/L、酸水解酪蛋白0.2?0.5 g/L、椰子汁100?200 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂
4.5 ?6.0 g/L, pH 为 5.8 ?6.2 ;
所述生根培养基为:改良MS、ΝΑΑ0.1?0.2 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂4.5?6.0 g/L,pH 为 5.8 ?6.2。
[0008]所述培养基中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤；NAA为1-萘乙酸；KT为6-糠氨基嘌呤(激动素)。
[0009]MS 主要包含以下成分:(I) NH4NO3 1650 mg/L, (2)KNO3 1900 mg/L, (3)CaCl2.2H20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H 20 370 mg/L, (5) KH2PO4 170 mg/L, (6) Na2-EDTA 37.3 mg/L、(7) FeSO4.7H 20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9) ZnSO4.7H 20 8.6 mg/L,
[10]H3BO36.2 mg/L、(Il)KI 0.83 mg/L、(12)Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、(13)CuSO4.5H200.025 mg/L, (14) CoCl2.6H20 0.025 mg/L, (15)盐酸硫胺素 VB1 0.1 mg/L, (16)烟酸 0.5mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/L、(19)盐酸P比唆醇 VB6 0.5 mg/L。
[0010]步骤(3)、(4)中所述的改良MS 为:(1) NH4NO3 1650 mg/L、⑵ KNO3 1900 mg/L, (3)CaCl2.2H20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H20 370 mg/L、(5) KH2PO4 170 mg/L、(6) Na2-EDTA 37.3mg/L, (7) FeSO4.7H20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9) ZnSO4.7H 20 8.6 mg/L、(1)H3BO3 6.2 mg/L, (Il)KI 0.83 mg/L, (12)Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, (13)CuSO4.5H20 0.025 mg/L, (14) CoCl2.6H20 0.025 mg/L, (15)盐酸硫胺素 VB1 0.3 mg/L, (16)烟酸 0.5 mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/L。
[0011]内源维生素在植物代谢过程中起着重要的催化作用，而当细胞或组织处于离体培养时自身合成的维生素不能满足生长需要，因此必须在培养基中添加生长所需的维生素。盐酸硫胺素(VB1)和盐酸吡哆醇(VB6)是两种常用的维生素，但盐酸硫胺素(VB1)是所有细胞和组织必需的基本维生素，而盐酸吡哆醇(VB6)对许多植物的细胞可能不是必需的。
[0012]所述步骤(3)、(4)中所用的改良MS，则是根据海菜花培养丛生芽和生根苗的生长需要增加盐酸硫胺素(VB1)用量，减少盐酸吡哆醇(VB6)用量。经改良MS培养的丛生芽和生根苗比用MS培养的粗壮、生长好，形成丛生芽和生根所需的时间也较短，减少了培养基制作程序和培养用电量，可节约种苗培养成本。
[0013]由于海菜花特殊的生活环境和组织结构，使其叶片、芽、花及根等均非常难消毒灭菌，存在很高的污染率和死亡率。厚实的果皮及表面网纹结构，可保护果实内部的种子在消毒灭菌时不受伤害。本发明利用海菜花果实进行消毒灭菌，即保证了消毒成功率又不损伤种子。
[0014]所述海菜花果实从野外采集并用保鲜袋保湿，回实验室后马上处理应用；果实处理为先用自来水清洗果实表面后，用刀片轻轻除掉果皮上不易洗掉的污物，再用纱布取少许洗洁精擦洗。整个过程要轻，不能损坏果皮，否则会导致消毒不彻底，消毒液还会损伤种胚。
[0015]海菜花果实生长在水面下，表面附着有大量微生物，用单一的杀菌剂效果不理想。采用甲基托布津、酒精与升汞联合使用达到消毒灭菌目的，但要严格控制好使用浓度及作用时间。
[0016]所述甲基托布津的优选浓度为150 mg/L，浸泡时间为0.3 h。
[0017]所述70?75%(v/v)的酒精具有较强的渗透性，使细胞内蛋白变性而杀死果实表面的微生物，用于海菜花果实表面消毒的优选浓度为70%(v/v)，浸泡时间为2 min。
[0018]所述升汞是一种植物组织培养过程中外植体消毒灭菌常用的强力消毒剂，具有很强的灭菌作用，但也极易损伤植物材料，优选浓度为0.2%(w/v)，浸泡时间为15 min。
[0019]所述甲基托布津溶液浸泡、酒精溶液浸泡及升汞溶液浸泡时要不断地轻轻搅拌。
[0020]所述种子萌发培养基优选为:MS、6-BA 1.0 mg/L,NAA 0.1 mg/L、琼脂5.5 g/L、蔗糖 30 g/L，pHS5.8。
[0021]所述继代增殖培养基优选为:改良MS、6-BA 1.0 mg/L,KT 0.5 mg/L,NAA 0.1 mg/L、酸水解酪蛋白0.3 g/L、椰子汁150 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂5.5 g/L, pH为5.8。
[0022]所述生根培养基优选为:改良MS、NAA0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂5.5 g/L，pH为5.8 ο
[0023]步骤(2)中所述萌发培养基表面加4?6cm的无菌水；培养条件:温度28±2°C的暗培养。
[0024]步骤(3) (4)中所述培养基表面加4?6cm的无菌水；培养条件:光照强度20001ux、光照时间 10±2 h/d，温度 25±2°C。
[0025]步骤(5)中所述水质良好的水域为水质清澈的河流、沟壑、水塘、水田等。
[0026]步骤(2)中将无菌果实用手术刀纵向切开，选取种皮为黑色或褐色的种子接到萌发培养基中培养2天开始萌发，5?10天形成长2?6cm的幼芽。
[0027]将步骤(2)中种子萌发形成的无菌幼芽去除胚根和叶片后，转接到继代增殖培养基中，增殖倍数为3.0倍/25天，芽苗粗壮、叶色浓绿。
[0028]将植株高度达到4cm的芽苗转接到生根培养基中，培养10天可见新根形成，30天时生根率高达100%。
[0029]将生根后的试管苗在水质良好的水域中进行移栽，60天的成活率达85%以上，植株生长良好。
[0030]本发明的优点为:
本发明方法有效地解决了组织培养过程中，沉水植物海菜花的外植体消毒灭菌难题，即控制了污染又保证了材料不受损伤，污染率控制在5%以内。
[0031]本发明方法建立了一整套完整的海菜花种子萌发、幼芽继代增殖、试管苗生根培养技术，继代25天繁殖系数达3倍以上，且种苗质量好，直接移栽野外60天成活率达85%以上，能在较短时间内获得大量增殖，一定程度上可实现工厂化种苗生产。具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强、应用价值高等特点，对海菜花物种保护和可持续利用具有重要意义和良好的应用前景。
【附图说明】
[0032]图1海菜花果实及种子；
图2为实施例1海菜花种子萌发培养5 d的生长情况；
图3为实施例1海菜花幼芽继代增殖培养25 d的生长情况；
图4为实施例1海菜花芽苗生根培养30 d的生长情况；
图5为实施例1海菜花生根苗移栽水塘30 d的生长情况。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例和附图对本
【发明内容】
作进一步的阐述，但不是对本发明的限制。实施例中未注明具体条件及操作的实验方法，按照常规方法，或按照说明书上制造商提供的要求进行。除非特别定义，本发明中所使用的专业用语均为本领域科技人员熟悉的含义。
[0034]培养基的制备:
有机添加物的制备:用电子天平称取所需量的酸水解酪蛋白直接溶解于适量的去离子水中，形成水溶液备用；椰子汁为从市