杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Cry2Ab蛋白质通过在植物中 表达来控制斜纹夜蛾为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 斜纹夜蛾Spodopteralitura属鳞翅目夜蛾科，为杂食性和暴食性害虫，为害寄主 相当广泛，除玉米和大豆外，还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及十字花科蔬菜、粮 食、经济作物等近100科、300多种植物；斜纹夜蛾属世界性分布，国内各地都有发生，主要 发生在长江流域和黄河流域。斜纹夜蛾主要以幼虫为害全株、低龄时群集叶背啃食；3龄后 分散为害叶片、嫩茎、老龄幼虫可蛀食果实。
[0003] 玉米和大豆是中国重要的粮食作物，每年因斜纹夜蛾造成的粮食损失巨大，更甚 者影响到当地人口的生存状况。为了防治斜纹夜蛾，人们通常采用的主要防治方法有：农业 防治、化学防治和物理防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于斜纹夜蛾发生的农田生态环境。如清除杂草，收获 后翻耕晒土或灌水，以破坏或恶化其化蛹场所，有助于减少虫源；或者结合管理随手摘除卵 块和群集危害的初孵幼虫，以减少虫源。因农业防治大多为预防性措施，应用有一定的局限 性，不能作为应急措施，在斜纹夜蛾爆发时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是斜纹夜蛾综合治理的重 要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是斜纹夜蛾大发生的情况 下，是必不可少的应急措施，它可以在斜纹夜蛾造成危害前将其消灭。目前化学防治方法主 要是药剂喷施。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产 生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全 构成威胁等不良后果。
[0006] 物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如 光、电、色、温湿度等及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用比较广泛 的方法主要有点灯诱蛾、糖醋诱杀和柳枝蘸洒500倍敌百虫诱杀蛾子；上述方法虽然有不 同程度的防治效果，但是在操作上具有一定的难度。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研宄发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物 虫害。Cry2Ab杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌产生的不溶性伴孢 结晶蛋白。
[0008] Cry2Ab蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环 境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中 肠上皮细胞膜上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压 变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
[0009] 已证明转Cry2Ab基因的植株可以抵抗草地贪食夜蛾害虫的侵害，然而，至今尚无 关于通过产生表达Cry2Ab蛋白的转基因植株来控制斜纹夜蛾对植物危害的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Cry2Ab蛋 白的转基因植株来控制斜纹夜蛾对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学 防治和物理防治等技术缺陷。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制斜纹夜蛾害虫的方法，包括将斜纹夜蛾 害虫至少与Cry2Ab蛋白接触。
[0012] 进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的宿主细胞中，所述 斜纹夜蛾害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Cry2Ab蛋白接触。
[0013] 更进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的转基因植物中， 所述斜纹夜蛾害虫通过摄食所述转基因植物的组织至少与所述Cry2Ab蛋白接触，接触后 所述斜纹夜蛾害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对斜纹夜蛾危害植物的控制。
[0014] 所述转基因植物可以处于任意生育期。
[0015] 所述转基因植物的组织为叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花蕾、花药或花丝。
[0016] 所述对斜纹夜蛾危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0017] 所述植物来自玉米、大豆、棉花、甘薯、芋、莲、田菁、烟草、甜菜、白菜或茄子。
[0018] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 优选地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0020] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述Cry2Ab 蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0021] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、a-淀粉酶或过氧化物酶。
[0022] 优选地，所述第二种核苷酸编码CrylFa蛋白或Vip3Aa蛋白。
[0023] 进一步地，所述CrylFa蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。
[0024] 更进一步地，所述第二种核苷酸具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。
[0025] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Cry2Ab蛋白质控制斜纹夜蛾害虫的用途。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制斜纹夜蛾害虫的植物的方法，包 括向所述植物的基因组中引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制斜纹夜蛾害虫的植物种子的方 法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的 多核苷酸序列的种子
[0029] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制斜纹夜蛾害虫的植物的方法，包 括：
[0030] 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0031] 使所述植物种子长成植株；
[0032]使所述植株在人工接种斜纹夜蛾害虫和/或斜纹夜蛾害虫自然发生危害的条件 下生长，收获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物 损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
[0033] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0034] 本发明术语"控制"和/或"防治"是指斜纹夜蛾害虫至少与Cry2Ab蛋白接触，接 触后斜纹夜蛾害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，斜纹夜蛾害虫通过摄食植物 组织至少与Cry2Ab蛋白接触，接触后全部或部分斜纹夜蛾害虫生长受到抑制和/或导致死 亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种 效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培 养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制斜纹 夜蛾害虫的植物和/或植物种子，在人工接种斜纹夜蛾害虫和/或斜纹夜蛾害虫自然发生 危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限 于改善的茎杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Cry2Ab蛋白对斜纹夜蛾的"控 制"和/或"防治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"斜纹夜蛾害 虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷 酸序列）的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Cry2Ab蛋白和/或可控制斜纹 夜蛾害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响Cry2Ab蛋白对斜纹夜蛾的"控 制"和/或"防治"作用，也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所 述另一种物质实现，而与Cry2Ab蛋白无关。通常情况下，在大田，斜纹夜蛾害虫摄食植物组 织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种斜纹夜蛾害虫和/或斜纹夜蛾害虫 自然发生危害的条件下，如转基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何组 织存在死亡的斜纹夜蛾害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的斜纹夜蛾害虫、和/或与非 转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即 通过斜纹夜蛾害虫至少与Cry2Ab蛋白接触以实现控制斜纹夜蛾害虫的方法和/或用途。
[0035] 在本发明中，Cry2Ab蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry 类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因 植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物 (第1亲本）可以通过遗传工程操作表达Cry2Ab蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通 过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲 本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本 发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0037]在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征， 将鳞翅目分为亚目、总科、科等，而夜蛾科是鳞翅目中种类最丰富的科，全球已经发现了超 过2万种夜蛾科昆虫，其中绝大部分为农业害虫；中国已报道夜蛾科昆虫有2110种，分属 18个亚科514个属，其中在中国最常见的夜蛾科害虫为棉铃虫、小地老虎、大螟和草地贪 夜蛾等。尽管斜纹夜蛾与棉铃虫、小地老虎、大螟和草地贪夜蛾同属于夜蛾科，除了在分类 标准上存在相似性，在其它形态结构上则存在极大差异；就好比植物中的草莓与苹果一样 (同属于蔷薇目蔷薇科），它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及植 株形态却是千差万别。斜纹夜蛾不管是从幼虫形态还是成虫形态上来看，都具有其独特的 特征。例如斜纹夜蛾幼虫头部黑褐色，胸部多变，从土黄色到黑绿色都有；斜纹夜蛾成虫体 暗褐色，胸部背面有白色丛毛，前翅灰褐色，花纹多。而同属于夜蛾科的草地贪夜蛾幼虫初 孵时全身绿色；草地贪夜蛾成虫灰棕色，雌虫前翅灰色至灰棕色，雄虫前翅更黑，具黑斑和 浅色暗纹。
[0038] 同属夜蛾科的昆虫不仅在形态特征上存在较大的差异，同时在取食习性上也存在 差异。例如同为夜蛾科的棉铃虫，以钻蛀型为害棉花的棉铃或者玉米穗子，小地老虎为害玉 米等的茎基部，草地贪夜蛾以取食叶片、切根或钻入玉米穗等方式为害玉米，而斜纹夜蛾则