一种球子蕨无菌繁殖技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种球子蕨无菌繁殖技术。
【背景技术】
[0002]蕨类植物种类繁多，全世界约有70多个科超过12000种，分布广泛，其中热带和亚热带地区的种类尤其丰富；我国蕨类植物种类繁多，是蕨类植物分布最多的区域之一，约占世界蕨类种类的1/5，被称为蕨类王国。蕨类植物以其独特的观赏性状和生理特性己逐渐博得了越来越多人的青睐，在很多发达国家，蕨类植物己经成为花卉市场和园林应用中的重要组成部分，我国丰富的蕨类植物资源还需要被更多的开发出来以满足人们日益增长的需求，对观赏蕨类的研宄、开发和利用对丰富园林配置素材、拓展层次空间及提高生态效益等诸多方面都具有重要意义。
[0003]球子蕨sensibilis L.)为球子蕨科球子蕨属植物，中型的陆生蕨类。球子蕨在园林中常用作假山石的配景植物，也可配置于建筑物之背阴角隅，还可盆栽用作室内观叶植物，观赏价值较高。蕨类植物的繁殖主要通过孢子播种、分株、压条等方式进行，但繁殖系数低，生长周期长，同时易受外界环境条件等因素的影响。目前尚未见对于球子蕨繁殖技术方面的研究报道，本发明以球子蕨孢子为外植体，经过孢子萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化及生根等过程获得了球子蕨离体再植株，建立球子蕨的无菌繁殖技术体系，以应用于规模化生产同时促进其在园林中的广泛应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种球子蕨无菌繁殖技术，本发明以球子蕨孢子为外植体，经过孢子萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化及生根等过程获得了球子蕨离体再植株，建立球子蕨的无菌繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种球子蕨无菌繁殖技术，包括以下的步骤:
(I)孢子消毒:将孢子置于1.5mL(或2mL)离心管中，蒸懼水浸泡I?3h,以4000r/min速度离心5?1min,去上清液。加入3%?5%的次氯酸钠溶液进行消毒5?15min,再4000r/min速度离心5?1min,去上液,用无菌水冲洗4?5次,加无菌蒸懼水配制成浓度约为6000个/mL的孢子悬浮液备用。
[0006](2)孢子萌发培养:取经步骤(I)处理后的孢子悬浮液0.5mL接种于萌发培养基中进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为23?25°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养20天后统计孢子萌发率。
[0007](3)愈伤组织诱导培养:将步骤(2)萌发培养得到的单个原叶体茎接种到诱导培养基进行愈伤组织诱导。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为23?25°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养40天后统计愈伤组织诱导情况。
[0008](4)丛生芽诱导及增殖:将步骤(3)诱导出的愈伤组织切割成大小(3mmX 3mm) —致的团块并接种到分化培养基中进行丛生芽诱导和增殖。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为23?25°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养40天后统计丛生芽分化情况。
[0009](5)生根培养:将步骤(4)诱导出的丛生芽切割成单芽后接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?40001χ，置于培养温度为23?25°C，空气相对湿度为75%?80%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0010](6)炼苗移栽:当孢子体苗根长到约2cm、茎高约3cm时，将培养瓶瓶盖打开，在通风处炼苗3?5天。取出生根苗，洗去根部培养基，移栽到经过高温灭菌的由草炭:蛭石=1:1的混合成的基质中，覆盖保鲜膜保持一定湿度，I周后揭膜，移栽20天后统计成活率。
[0011]上述步骤(2)所述的萌发培养基为:1/21^+20?3(^/1蔗糖+3.5?6.(^/1琼脂+50 ?100mL/L 椰子汁，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的诱导培养基为:MS+0.5?2.0mg/L 2，4-D+1.0?3.0mg/LKT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(4)所述的分化培养基为:MS+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L琼脂，pH为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?1.0mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0015]与现有技术相比本发明的优点是:球子蕨(sensibilis L )为球子蕨科球子蕨属植物，中型的陆生蕨类。随着蕨类植物逐渐受到人们的关注，市场需求量日益增加，在自然条件下蕨类植物主要通过孢子和根莲进行繁殖，存在繁殖系数低、周期长等缺点，不利于球子蕨的市场化生产。目前，关于球子蕨的无菌繁殖技术尚未有相关报道，本发明以球子蕨孢子为外植体，经过孢子萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化及生根等过程获得了球子蕨离体再植株，建立球子蕨的无菌繁殖技术体系，以促进球子蕨的规模化生产。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0017]实施例1
(I)孢子消毒:将孢子置于1.5mL(或2mL)离心管中，蒸懼水浸泡2h,以4000r/min速度离心5min,去上清液。加入3%的次氯酸钠溶液进行消毒5min,再4000r/min速度离心6min,去上液,用无菌水冲洗4次,加无菌蒸懼水配制成浓度约为6000个/mL的孢子悬浮液备用。
[0018](2)孢子萌发培养:取经步骤(I)处理后的孢子悬浮液0.5mL接种于萌发培养基中进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为25001x，置于培养温度为23°C，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后孢子萌发率为75.7%。所述的萌发培养基为:l/2MS+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂 +100mL/L 椰子汁，pH 为 5.5。
[0019](3)愈伤组织诱导培养:将步骤(2)萌发培养得到的单个原叶体茎接种到诱导培养基进行愈伤组织诱导。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为23°C，空气相对湿度为75%的条件下培养40天后愈伤组织诱导率为73.6%。所述的诱导培养基为:MS+0.8mg/L 2，4-D+l.5mg/L KT+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0020](4)丛生芽诱导及增殖:将步骤(3)诱导出的愈伤组织切割成大小(3mmX 3mm) —致的团块并接种到分化培养基中进行丛生芽诱导和增殖。接种后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，置于培养温度为23°C，空气相对湿度为75%的条件下培养40天后丛生芽分化率为89.3%。所述的分化培养基为:MS+20g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.4。
[0021](5)生根培养:将步骤(