一种防风的组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种防风的组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002]培Saposhnikovia di vari ca ta)为伞形科药用植物，其干燥根入药，含有多种生物化学成分，具有解热、镇痛、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗病毒等作用。传统的防风获取方法是采挖野生植物资源，由于盲目挖掘，不仅使野生资源日益减少而且严重破坏了自然界的生态平衡。此外，栽培品种的种性退化，产量和品质下降，不能适应规模化和标准化生产的需要。
[0003]目前关于防风的研究主要集中在植物资源、化学成分分析、生药鉴定、药理作用和临床应用等方面，这些研究为以防风为基源制剂的临床应用奠定了一定的基础。随着生物技术的发展，组织培养技术为防风的规模化生产开辟了新的途径。至今为止，尚未见有关防风离体再生体系的所道，这严重影响了防风种苗繁殖的发展。因此，非常有必要建立系统的防风离体快繁体系，为防风种苗工业化生产提供技术支持。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种防风的组织培养快繁方法，本发明以种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖培养、不定芽诱导、根苗诱导以及试管苗驯化移栽等过程实现了防风的组织培养快速繁殖，从而实现本发明的目的。
[0005]本发明的一种防风的组织培养快繁方法，包括以下的工艺步骤:
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的防风种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗10?30min后置于清水中浸泡8?12h,再转入50?120mg/mL的赤霉素溶液中浸泡10?15h，然后在超净工作台中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，无菌水冲洗3?5次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用。
[0006](2)愈伤组织诱导:用无菌解剖刀在经步骤(I)处理后的种子上割I?3刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在25?28°C条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织。
[0007](3)增殖培养:愈伤组织生长至20?30天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，20天左右转接一次。
[0008](4)不定芽诱导:将培养至15?20天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养2?5天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽。
[0009](5)生根培养:当丛生芽长至2.5?3.5cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?4天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根。
[0010](6)试管苗移栽:当小苗长出的新根系长达2?3.5cm,并且长出侧根，苗闻5cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
[0011]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+ I?5mg/L 2，4-D+ 0.5?2mg/L 6-BA+0.1 ?lmg/L KT+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为
5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.5?3.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(4)所述的分化培养基为:MS+0.1?0.5mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(5)所述的生根培养基为:l/2MS+0.05?0.5mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0015]本发明的优点是:以防风种子为外植体建立了防风离体快繁体系，以适应规模化和标准化生产的需要。本发明以种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖培养、不定芽诱导、根苗诱导以及试管苗驯化移栽等过程实现了防风的组织培养快速繁殖，为防风种苗工业化生产提供技术支持。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0017]实施例1:
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的防风种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗1min后置于清水中浸泡8h,再转入80mg/mL的赤霉素溶液中浸泡1h,然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒5min,无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用。
[0018](2)愈伤组织诱导:用无菌解剖刀在经步骤(I)处理后的种子上割I刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在28°C条件下进行全暗培养25天即可形成愈伤组织，诱导率高达96.8%。所述的诱导培养基为:MS+ 3mg/L 2, 4-D+ 0.5mg/L6-BA+ 0.3mg/L KT+3.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.08% 活性炭，pH 值为 5.8。
[0019](3)增殖培养:愈伤组织生长至23天后，将长势良好的愈伤组织转接至增殖培养基中进行增殖培养，接种后先在28°C条件下全暗培养2天，然后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，培养温度为28°C的条件下培养，23天转接一次，愈伤组织生长迅速，呈黄绿色，质地紧密，愈伤增殖倍数达5.8。所述增殖培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。
[0020](4)不定芽诱导:将培养至15天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，培养温度为28°C的条件下培养15天后愈伤组织逐渐变绿，并形成很多突起，进而形成多芽体，分化率高达86.3%。所述的分化培养基为:MS+0.3mg/L NAA+1.5mg/L6-BA+2.5%蔗糖+0.5%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。
[0021](5)生根培养:当丛生芽长至2.5?3.5cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养2天，然后置于每天光照14小时，光照强度为20001x，培养温度为28°C的条件下培养15天后开始生根，生根率达88.4%，