一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及葡萄胚性愈伤组织诱导技术领域，具体涉及一种葡萄胚性愈伤组织的 诱导和培养方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄是多年生落叶藤本衆果类果树，属葡萄科（Vitaceae. Lindl)葡萄属 (VitisL.)植物。葡萄组织培养开始于二十世纪四十年代，葡萄再生体系发生的途径主要有 器官发生途径和体细胞胚发生途径，但与器官发生相比，体细胞胚发生产生的胚性细胞分 散性好，生长旺盛、生理生化代谢活跃、生命力强且易于分化，以胚性愈伤组织作为遗传转 化的受体，植株再生性高，遗传操作的效果较好，因此，在葡萄转基因技术研宄过程中，再生 体系主要以体细胞胚发生途径为主。迄今为止，已有11种葡萄属植物成功地再生出植株， 并已被部分学者应用于葡萄遗传转化，获得少量转基因植株。因此，葡萄再生技术的发展为 进一步拓宽繁殖葡萄种类以及葡萄遗传转化开辟了更加广阔的前景。但目前葡萄再生大多 集中于砧木品种，且再生效率低、重复性差，导致遗传转化率低，基因工程改良葡萄品种进 展缓慢。
[0003] 愈伤组织由葡萄的外植体经过不同培养基诱导后能否诱导产生体细胞胚，取决于 是否诱导出有胚性的愈伤组织。一般将诱导产生的愈伤组织划分为三类：（1)淡黄色有明 显颗粒状的愈伤组织：体积较小，质地坚硬，多次继代之后会发生褐化，但在发育后期可产 生不同形态的胚状体，这一类属于胚性愈伤组织（Embryo callus，EC) ; (2)黄色愈伤组织： 质地疏松，愈伤组织在发育后期没有诱导出胚状体，被称之为非胚性愈伤组织（NE) ;(3)白 色愈伤组织：体积较大、质地疏松、增长速度较快，多次继代会发生褐化且水渍化，这一类型 属于非胚性愈伤组织（NE)。
[0004] 授权公告号为CN102499079B的中国发明专利公开了一种葡萄体细胞胚发生的方 法。该方法采集开花前5-7天的花蕾，再清洗消毒并吸干水分备用；将单个雄蕊取出接种在 培养基上进行培养；选取浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培 养基上进行培养；将得到的诱导形成的体细胞胚继代在同样的培养基上进行培养；将得到 的体细胞胚同样继代在培养基上进行培养。
[0005] 授权公告号为CN103444523B的中国发明专利公开了一种花药快速诱导胚性愈伤 组织再生植株的方法。该方法采集葡萄盛花前12-14天的花蕾，进行花药愈伤组织培育、愈 伤组织分化培养及分化苗生根培养。
[0006] 不管是以上是花药为原材料进行胚性愈伤组织诱导，还是以种子为原材料进行胚 性愈伤组织诱导，均存在一个致命的缺点，那就是原材料的取材受时间季节的限制，不能够 实现根据实验或生产的需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种葡萄胚性 愈伤组织的诱导和培养方法，该方法以葡萄幼嫩茎段为外植体诱导形成胚性愈伤组织，步 骤简单，取材不受时间季节的限制，耗时短，诱导率高，建立高效的葡萄胚性愈伤组织培养 体系，提高葡萄胚性愈伤组织的产量，有效地解决了葡萄胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低 的问题，为建立葡萄组织培养体系、快速繁育葡萄组培苗奠定基础，是一条提高葡萄组培苗 产量的有效途径。
[0008] 本发明所采用的技术方案为：
[0009] 一种葡萄胚性愈伤组织的诱导和培养方法，该方法包括以下步骤：
[0010] (1)外植体的选取：选取抗病、早熟、高产的葡萄植株，取葡萄植株的嫩梢为外植 体，经过修剪、消毒洗涤，得到无菌葡萄茎段；
[0011] (2)愈伤组织的诱导培养：将无菌葡萄茎段置于葡萄愈伤组织诱导培养基上进 行诱导培养，得到初级培养葡萄愈伤组织；将得到的初级培养葡萄愈伤组织再转接至葡萄 愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的葡萄愈伤组织，所述葡萄愈伤组织 诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮 L 0-3. 0g/L、6-苄氨基腺嘌呤 L 0-2. 5mg/L、a-萘乙酸 0· 1-0. 5mg/L，pH 值 5. 8 ;
[0012] (3)胚性愈伤组织的培养：将得到的葡萄愈伤组织转接至胚性愈伤组织培养基中 进行培养，得到胚性愈伤组织，所述胚性愈伤组织培养基以MS培养基为基础培养基，并添 加蔗糖30g/L、琼脂7g/L、聚乙烯吡咯烷酮L 0-3. 0g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸0· 5-1. 5mg/L、 6-苄氨基腺嘌呤 0· 5-2. Omg/L、a-萘乙酸 0· 05-0. 5mg/L，pH 值 5. 8。
[0013] 所述步骤⑵中诱导培养的培养条件为：培养温度（25 ± I) °C、湿度60-70%，先暗 培养两周，再光培养25-35天，光培养按光照强度20001x下16h、暗条件下8h交替进行。
[0014] 所述步骤⑵中继代培养的培养条件为：培养温度（25 ± I) °C、湿度60-70%，先暗 培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度20001x下16h、暗条件下8h交替进行。
[0015] 所述步骤（3)中的培养条件为：培养温度（25 ±1)°C、湿度60-70%，暗培养55-65 天左右。
[0016] 葡萄体细胞胚胎发生受到内因和外因的影响，内因主要有基因型、外植体类型以 及发育阶段等；外因为培养基成分、光照等因素。基本培养基保证培养物的生存与最低的生 理活动，但只有配合使用适当的植物激素，才能使培养物健壮的生长，因此培养基激素组合 的选取是决定植物组织培养成败的关键因素。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点 和有益效果：
[0017] (1)选取葡萄植株的嫩梢为原材料进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养，取材方便， 不受时间、季节等气候条件的限制，可根据需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养；
[0018] (2)选用合适的愈伤组织诱导培养基和胚性愈伤组织培养基，特别是选用合适的 细胞分裂素和生长素，以及选取合适的细胞分裂素和生长素的配比，