一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粳稻花药培养培养基配方，具体涉及一种可以显著降低褐化、高 效率地诱导粳稻花药诱导培养的培养基配方，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 花药是植物的雄性器官，花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段 的花药。通过无菌操作接种在培养基上，在一系列条件诱导下改变花药的发育程序，进行有 丝分裂，经过脱分化后形成细胞团，进而形成愈伤组织，经历再分化发育成完整的单倍体植 株的过程。
[0003] 1964年，印度德里大学的两位植物学家Guha和Maheshwari发现，他们培养的毛叶 曼陀罗花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植株。1968年，日本的Niizeki和Oono 通过花药培养得到了单倍体水稻植株。随着研究的不断深入，花药培养技术逐步得以进步， 并应用于水稻遗传育种。
[0004] 水稻花药培养育种是育种学发展的趋势之一，它集成了杂交育种、诱变育种、细胞 学、遗传学等各种生物科学的内容。利用花药培养可以明显的加快育种进程、缩短育种年 限。花药培养形成的单倍体植株加倍后每个基因均以纯合体的形式存在，各种优良和不良 的性状在早期世代表现出来，便于进行筛选和淘汰。
[0005] 我国水稻花药培养技术研究始于20世纪70年代，在水稻育种研究中得到了不断 的改良和完善，花药培养的效率得以提高，也带动了其他作物的花药培养的进度，有大量通 过利用该技术培育出的籼粳稻品种已经通过了审定，并且得到了大面积的推广。自1975年 中国科学院北京植物研究所、黑龙江省农业科学院作物育种研究所和松花江地区农业科学 研究所水稻实验站组成的单倍体育种协作组首次育成粳稻品种"单丰1号"以及1976年中 国科学院遗传所和天津市农科所育成了 "花育1号"和"花育2号"以来，我国实现了花培 育种从理论到应用的突破，也促进了国内外的花培育种技术的发展。常规育种与花药培养 技术结合起来育成了大量水稻新品种通过审定，比较有代表性的有20世纪80年代的中国 农科院的"中花"系列，其中中花8号、中花9号和中花10号年种植面积曾达到2万hm。90 年代的江西农科院选育的"赣籼"系列，黑龙江省农业科学院水稻研究所选育出了龙粳系列 品种，2000年后又有不冋的中花品种和龙梗品种被成功选育。经过30多年来全国各地育种 研究队伍的潜心研究，目前我国已有一大批通过花培育种的品种产生，并且大面积推广应 用。随着花药培养的遗传特性、生理生化等不断深入研究，现在水稻花药培养已经成为当今 生物技术育种中较为实用、有效的育种新技术，我国水稻花药培养育种的应用研究在国际 上一直保持领先地位。
[0006] 从品种选育的角度看，花药培养获得的再生植株越多，获得优良基因型的概率越 大。水稻的生长发育是由自身基因与环境因素共同决定的，由于受培养基组分、材料的差异 性以及培养环境等的影响，目前花培效率还不够理想，获得的再生植株群体小，花培后代的 表现型不充足，这使选择、利用受到较大的限制。提高花药培养的诱导频率和花培绿苗频 率，增大花培后代的群体，是水稻花培技术在遗传育种上扩大应用的前提和基础。为此，仍 然需要进行不懈的努力。
[0007] 培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是 影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合 关系，可导致花培效率的大幅度提高。继续筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对 性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研究发现一些有机附加物可以显著提高花药培 养力，发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进一步提高花药培养力。
[0008] 水稻花药培养的过程需要进行三个步骤：诱导培养，即将花药剥离在诱导培养基 上先脱分化诱导出花药愈伤组织；分化培养，即将花药愈伤组织转移到分化培养基上再分 化生出具有根和芽的绿苗的过程；继代培养，即将分化出的幼小植株转移至继代培养基上 生长成健壮植株的过程。其中，花药诱导培养是水稻花药培养过程的重点也是难点，水稻花 药愈伤组织诱导的频率和质量直接决定着花药培养的成败，因此，组合和优化培养基组分， 摸索出高效的水稻花药诱导培养基配方是提高花药培养诱导频率的关键。
[0009] 通过多年粳稻花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且 不断尝试加入一些提高粳稻药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出 了一种可以显著降低培养材料和培养基的褐化反应、高效率地诱导粳稻花药诱导培养的培 养基配方。我们的研究结果对于进一步推广和应用水稻单倍体育种和理论研究无疑有较大 的现实意义和实用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基，该培养基的配方如 下： KNO3 2200 ~2600mg/L，（NH4)2SO4 370 ~430mg/L，KH2PO4 330 ~370mg/L，CaCl2* 2H20 130 ~150mg/L，MgSO4* 7H20 150 ~170mg/L，Na2-EDTA 30 ~35mg/L，FeSO4* 7H20 22 ~ 26mg/L，MnSO4* 4H 20 3. 6 ~4. 2mg/L，ZnSO4* 7H 20 I. 2 ~I. 4mg/L，H3BO3 I. 3 ~I. 5mg/ L，KI 0? 6 ~0? 7mg/L，丙三醇 6 ~7mg/L，Na3C6H5O7* H 20 0? 45 ~0? 55mg/L，叶酸 0? 45 ~ 0? 55mg/L，甘氨酸2. 7~3. 3mg/L，丙氨酸2. 2~2. 8mg/L，赖氨酸I. 8~2. 2mg/L，维生素 BI L 8~2. 2mg/L，维生素B6 0? 9~I. lmg/L，烟酸0? 9~I. I mg/L，氯化2-羟乙基三甲 铵220~280mg/L，蔗糖50~60g/L，植物凝胶5~6g/L ; 2,4_D 3. 6 ~4. 4mg/L，NAA 3. 6 ~4. 4mg/L，复駄核酸 0? 45 ~0? 55mg/L，水解蛋白 0? 45 ~0? 55g/L，活性炭 2. 5 ~3. Og/L，牛磺酸 0? 07 ~0? 08mg/L，生物素 0? 07 ~0? 08mg/ L，植物硫化激动素 PSK a 27 ~33pmol/L，PH 5. 8-6. 0。
[0011] 本发明所述的培养基具有高效率地诱导粳稻花药愈伤组织、降低褐化的优点，可 以大幅度地提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所 述培养基的特点。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 配制如下配方的培养基： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0? 65mg/L，丙三醇 6. 5mg/L，Na3C6H5O7* H2O 0? 5mg/L，叶酸 0? 5mg/L，甘氨酸3. Omg/L，丙氨酸2. 5mg/L，赖氨酸2. Omg/L，维生素BI 2. Omg/L，维生素 B6 lmg/L，烟酸lmg/L，氯化2-轻乙基三甲铵250mg/L，鹿糖55g/L，植物凝胶5.5g/L; 2.4- D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸 0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭 2.75g/L， 牛磺酸0. 〇75mg/L，生物素0. 075mg/L，植物硫化激动素PSK a 30pmol/L，PH 5. 9。
[0013] 选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药培养花药供体，采集单核晚期花药作为 供试材料，表面消毒后，4°C下低温预处理3天。预处理后，外植体灭菌（0. 1%升汞溶液，15 min)，抖药法接种花药于该诱导培养基中诱导愈伤组织，每个三角瓶接种50枚花药，在温 度为28°C、湿度为60%-70%的环境下暗培养。愈伤组织形成后(长到2mm左右)，计算愈伤组 织诱导率。
[0014] 实施例2 配制如下配方的培养基(丙氨酸添加浓度的优选）： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0? 65mg/L，丙三醇 6. 5mg/L，Na3C6H5O7* H2O 0? 5mg/L，叶酸 0. 5mg/L，甘氨酸3.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素BI 2.0mg/L，维生素B6 lmg/L，烟酸 lmg/L，氯化2-轻乙基三甲铵250mg/L，鹿糖55g/L，植物凝胶5.5g/L; 2.4- D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸 0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭 2.75g/L， 牛磺酸0. 〇75mg/L，生物素0. 075mg/L，植物硫化激动素PSK a 30pmol/L，PH 5. 9。
[0015]丙氨酸的添加浓度设置以下 10 种：〇 ;〇? 5 mg/L ;1 mg/L ;1. 5 mg/L ;2 mg/L ;3mg/ L ;3.5 mg/L ;4 mg/L，5 mg/L ;8 mg/L〇
[0016] 同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0017] 实施例3 配制如下配方的培养基(凝固剂的优选）： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 1. 3mg