采用耐盐强化活性纳米垃圾堆肥调节盐胁迫草坪草保护酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境保护技术领域，涉及一种采用耐盐强化活性纳米垃圾堆肥调节盐 胁迫草坪草保护酶的方法。
【背景技术】
[0002] 纳米科学技术（Nano-ST)是20世纪80年代末期崛起的一项新科技，它主要研宄 结构尺度在（l〇_7_l〇_9m)范围内物质的性质及其应用。因为纳米材料具有界面表面界面 效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子尺寸效应等基本特征，所以，出现了许多传统 材料不具备的奇异特性。纳米材料在吸收、催化、磁效应和敏感特性方面都表现出不同于传 统材料的特性，可与多个领域高度交叉，包括物理、化学、电子学、材料科学和生物学，在高 科技应用上显示出广大的潜力，所以，纳米材料的应用已经愈来愈受到科学家的关注。我国 政府十分重视纳米技术的研宄，并将纳米结构和纳米材料视为纳米技术的关键而加以优先 支持。2012年，中国工业和信息化部根据《国家"十二五"战略性新兴产业发展规划》的精 神，发布《新材料产业"十二五"发展规划》，将纳米材料列为前沿新材料领域，并明确指出： 中国将加大纳米技术研宄，积极地推动纳米材料在新能源、环境治理、节能减排和生物医用 等领域的研宄利用。
[0003] 国外对于纳米材料的研宄主要集中于对纳米材料安全性的研宄，主要研宄的五大 问题是：皮肤对纳米材料的吸收及其对皮肤的伤害；饮用含纳米颗粒水的后果；纳米颗粒 对动物肺部的影响；已变成水中沉积物的纳米颗粒对周围环境的影响2005年5月1日至4 日，欧共体内部在德国波恩举行"欧洲纳米生物效应会议"。会议讨论了纳米颗粒的形成、释 放，在环境中的运动和检测方法，它的急性毒害作用、慢性毒害作用以及细胞水平和分子水 平的影响，如对血细胞、肺部细胞、免疫细胞、DNA损伤、基因表达的影响等。国内还发展了 纳米材料对植物的影响，纳米肥料由中国农科院土壤肥料研宄所张夫道研宄员提出，并在 国家"863"项目中立项。纳米肥料是纳米生物科技的一个分支，是用纳米材料技术和医药 微胶囊技术构建改性而制成的全新肥料，分为纳米材料包膜、胶结缓释控释肥料与纳米结 构肥料。众所周知，滥用肥料导致的地下水污染已越来越严重，如何提高肥料利用率成为解 决问题的重点，纳米材料表面原子数目占完整粒子原子总数的80%以上，因为表面原子周 围缺少相邻的原子，含有许多悬空键，所以具有不饱和性，很容易与其他原子相结合而稳定 下来，从而表现出非常高的化学活性。与肥料结合能明显提高肥料的利用率，一方面是由于 纳米材料的磁效应，能够促进养分被植物吸收，刺激植物生长发育，并且还能提高植物体内 多种酶的活性。另一方面，是因为其表面效应，使纳米肥料表面能和表面结合能增大，帮助 其在土壤环境中被植物根系吸收，肥料使用的效果得到提高。有研宄表明，添加纳米碳肥料 增效剂能有效减缓土壤有效养分的下降，提高水稻产量，增产幅度在1. 9% -3. 5%之问。纳 米碳对水稻产量与氮肥利用率的影响，也证明了施用纳米碳粉可显著提高水稻产量，同时， 在适宜施氮量条件下，加施纳米碳粉有助于水稻氮肥利用率的提高。纳米材料胶结包膜型 缓/控释肥料对作物产量和品质的影响，结果表明，纳米材料胶结包膜型缓/控释肥料均有 助于小麦和玉米子粒产量和蛋白质产量的提高。目前研宄的纳米肥料多数为纳米材料增效 肥或纳米材料包膜肥，而将肥料本身加工到纳米粒径应用于草坪植物逆境胁迫的研宄，尚 无文献报道。
[0004] 微生物肥料又称为菌肥、生物肥料，主要作用表现在帮助作物营养吸收、提升化肥 利用率和农产品品质、增强作物抗逆性等方面。微生物肥料一般可分为两类，一类是微生物 通过自身的生命活动，增加可供植物吸收的营养元素；另一类，能够通过微生物生命活动的 次生代谢分泌激素，来促进植物生长和提高植物的抗逆性。如固氮微生物能够通过固氮作 用增加土壤氮素含量，微生物可以通过生命活动提高土壤中营养元素的转化和吸收，是大 多数微生物肥料的主要功能。此外，一些有益微生物可以通过自身的代谢活动产生多种糖 类物质，这些糖类物质不仅能与土壤中的胶类物质有机结合在一起，同时还可以与植物自 身产生的粘液结合在一起，起到改良土壤的作用。微生物菌剂还具有改善作物生长状况，增 强植物抗性等作用。目前大多数研宄已表明，微生物制剂能促进植物生长和营养元素的吸 收。有研宄者将其应用于水稻研宄，结果表明，与常规施肥相比，施加生物菌肥能有效促进 水稻产量的增加。也有人将筛选出的七种植物促生真菌应用于向日葵的培养研宄发，结果 证明，真菌可以明显促进其初期生长，并能有效抑制霜霉病的发生。综上所述，目前有关微 生物的研宄多侧重于有益微生物的提取、鉴定及应用，但将有益微生物进一步强化后应用 于草坪植物逆境生长的研宄尚无文献报道。
[0005] 草坪建植体系是集生态调控、美化环境和文化娱乐等多种功能为一体的生态工 程。作为城市园林绿化的重要组成部分，草坪绿地是衡量经济发展程度的标准之一，也是衡 量现代化城市的标准之一，是现代城市社会发展与经济实力的一个有力体现，草坪建植体 系的构建对于改善城市投资环境、招商引资、促进旅游等各个方面都起着不可忽略的作用。 草坪在带来景观和美化效果的同时，在维系生态系统平衡方面也发挥着重要作用。首先，它 能够净化空气、杀菌消毒，草坪通过光合作用吸收CO2放出O2保持空气中CO 2和02的平衡， 草坪还能稀释、分解、吸收和固定大气中的有毒气体、致癌物质和某些重金属气体等有毒物 质，通过光合作用变害为利。其次，草坪能够保持水土、维持生态平衡。草坪能致密覆盖地 表的草层，并且密集的根系能有效固着表土，防止地表径流的形成，降低表土被带走的可能 性。另外，草坪还可以减缓太阳辐射，有效降低地表温度、增加空气湿度。
[0006] 盐碱地(土)，是盐化土，碱化土和盐碱土的总称。近年来，土壤盐碱化不断的加 重。目前，我国有20X106hm2以上盐碱地和7X106hm2以上盐渍化土壤，约占耕地面积的 20%。不论是在干旱地区，还是在水资源丰富的沿海地区，盐胁迫都是一种十分严重的非生 物胁迫。而盐胁迫是限制草坪草生长的一个关键环境因素之一。大量的盐渍化土壤被荒废， 极大地浪费了土壤资源，阻碍了农业生产和城市绿化进程。盐分对作物的危害主要表现为， 种子发芽率降低、抑制生长减慢、根生长减慢、叶片发黄、伤害植物组织、造成植物细胞膜伤 害等现象，致使植物的生长发育受到严重限制。长期以来，盐碱土的改良主要采用的是灌溉 排水、施加化学改良剂或矿质肥料和种植耐盐碱的植物。针对以上问题，目前研宄主要集中 于选取抗逆性强的草坪植物、施用高效肥料、施用保水剂和改良剂等措施。纳米肥作为一种 新型的高效肥料，在植物逆境胁迫方面受到越来越多的关注。
[0007] 纳米肥料是一种特殊的高效肥料，其粒子的表面积、表面能及表面结合能都相对 较大，有助于其在土壤环境中被植物的根毛或根尖部分吸附，其特有性能有可能解决肥料 利用率、作物增产与植物抗性等问题。目前关于纳米肥料的研宄多数为纳米材料增效肥或 纳米材料包膜肥，而将肥料本身加工到纳米粒径应用于草坪植物的研宄，同样也未见相关 技术报道。
[0008] 生活垃圾堆肥是一个高渗体系，其中的微生物对逆境有一定的适应能力，将其中 有益微生物菌剂进一步强化后应用于草坪逆境建植具有重要意义。基于以上考虑，为了研 宄纳米堆肥及其有益微生物在草坪建植中的应用效果，本文中将垃圾堆肥经纳米加工技术 加工到30nm左右，并从生活垃圾堆肥中分离提取出合适的有益微生物菌株，通过进一步抗 性驯化，获得更为高效的强化微生物菌剂，将其按一定的体积比例混合后，制成复合微生物 菌剂，与纳米堆肥联合应用于胁迫等逆境胁迫下的草坪建植，通过探索其对逆境胁迫下草 坪植物生理生态特性的影响，以期为强化微生物联合纳米堆肥在逆境草坪建植中的应用， 促进逆境环境草坪植物的建植提供理论依据。
[0009] 微生物能显著促进植物生长，促进营养元素的吸收。另外，真菌能有效提高草坪植 物的抗寒性、抗旱性、抵抗生物危害等抗性。一些研宄结果表明，纳米堆肥对植物生长具有 明显的促进作用，但将纳米堆肥用于盐胁迫草坪建植的方面的技术尚无文献报道。
【发明内容】
[0010] 本发明从堆肥中提取耐盐微生物，将筛选得到纯种耐盐微生物，采用逐步提高 NaCl的浓度方法进一步强化练制成强化耐盐菌剂，与纳米堆肥联合施用于盐碱土草坪基质 中。实验设计轻度、中度和重度三种盐胁迫处理，实现强化微生物联合纳米堆肥增强草坪草 的抗盐性，目的为研制高效肥料，以达到调节草坪草的在盐胁迫下保护酶活性的增强，以达 到促进盐碱土草坪建植效果的目的。
[0011] 为实现上述目的本发明公开了如下的内容： 一种采用耐盐强化活性纳米垃圾堆肥调节盐胁迫草坪草保护酶的方法，其特征在于按 如下的步骤进行： (1) 纳米堆肥的制备： 将生活垃圾堆肥105°c烘干至恒重，将垃圾堆肥加工研磨制成30-35nm纳米堆肥，备 用； (2) 耐盐微生物菌剂的制备： 将堆肥样品称取IOg置于无菌锥形瓶中，加入IOOmL无菌水振荡均勾后，取IOmL悬浮 液于盛有IOOmL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为混合微生物 菌群；所述的混合微生物菌群中含有枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉； (3) 混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法，以减轻瞬间高浓度盐 对混合菌株造成的冲击和毒害，NaCl的浓度以0. 5%的梯度增加到3%，每增加一次NaCl的 浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继续增加 NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐微生物菌群； (4) 复合耐盐微生物菌剂的制备： 枯草芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉按体积比1:1:1的比例配制成复合耐盐微 生物菌剂，稀释100倍备用； (5) 草皮建植： 将土壤与盐碱土过筛除杂，按一定比例制成轻度0. 3%、中度0. 6%和重度0. 9%盐碱土， 将混合好的盐碱土在121 °C下灭菌30 min备用； 每个胁迫设3个处理，三个胁迫所设处理相同，分别为： 1) 以100% 土壤为对照基质并加入15 ml空白培养基 2) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml空白培养基 3) 土壤和纳米堆肥按59 :1的比例混合并加入15ml强化耐盐微生物菌剂 (5)以混合好的土壤为基质进行草坪植物栽培试验，实验时基质用量为9400gnT2,草皮 基质厚度为15 mm，高羊茅草种播种量为160gnT2,将种子浸泡24h后均匀播洒于基质表层， 首先进行黑暗处理，充分浇水保证萌发，萌发后进行培养，光照强度为450-700 μ mol. πΓ2. s'期间早晚定期浇一次水，经常调换培养草皮的位置以保证光照一致，室内的相对湿度为 40-55%，温度为20-25°C，实验进行50d后进行植物各指标的测定。其中所述的逐步增加 盐浓度的方法指的是：NaCl的浓度分别为0. 5%、1%、1. 5%、2%、2. 5%和3%，在驯化过程中，视 〇D_增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以0. 5%的梯度