基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种繁殖白及种苗的方法，具体涉及一种基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，即先将白及种子在无菌的液体培养基中培养形成原球茎，再将原球茎播种到栽培基质中继续培养，属于植物种苗快速繁殖技术领域。
【背景技术】
[0002]兰科植物种子非常小，被称为“粉尘”种子(dust seed)，是兰科植物的一个重要特征。兰科植物的种子长0.05-6.0mm，直径0.01-0.9mm，单粒种子重约0.31-24 μ g，种胚也非常小，如坛花兰(Acanthephippium sylhetense) 0.058X0.042mm, 一枚果实中种子数量最高达4百万粒！Roberts、张燕对白及的种子测量为:长1.20mm,宽0.23mm，种胚长0.38mm,宽0.22mm，Kiyohara的测量结果为:种子长1.80mm,宽0.23mm,种胚长0.49mm,宽0.21mm。
[0003]由于兰科植物种子非常小，通常认为兰科植物种子中所储藏的营养物质不足以使其萌发并产生一株自养性的幼苗，因此与真菌共生是必需的，但是现有资料显示兰科植物对真菌的依赖程度存在差异。不同类型的兰科植物对菌根真菌(mycorrhiza)营养性依赖差异非常大；附生型的可能在种子萌发阶段与真菌相关联，而成年个体在营养上可能不依赖菌根真菌；陆生型的种类则表现对菌根真菌为持续性依赖，美国的舌唇兰(Plantanthera)、欧洲的蜂兰(Ophrys)及澳洲的蜘蛛兰(Caladenia)是陆生型的代表，菌根真菌对其生长发育至关重要。
[0004]白及(Bletilla Striata，亦称白芨)系兰科白及属多年生陆生型草本，本属约6种，我国4种，陕南分布3种，不仅观赏价值较高，亦是常用中药之一，其作用为收敛止血，消肿生肌，用于咯血吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂，肺结核咯血，溃疡病出血。白及不仅药用价值高，而且极具观赏价值，也是我国现代医药工业和化妆品工业的重要原材料。
[0005]近年来，随着我国中医药事业的发展，白及在临床上的应用范围不断扩大，白及的用药需求急剧增加。
[0006]白及种子非常细小且无胚乳，在自然条件下很难萌发和生长。目前白及繁殖主要采用营养繁殖，有两种方式:
[0007]1、分株繁殖，为白及常规繁殖方式，即将白及块茎一分为二，分株繁殖春季或秋季均可进行，但其周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，加之长期无性繁殖易引起种质退化，很难适应规模化种植的需要及满足大量栽培的需要。
[0008]2、植物组织培养，在1960年前后Morel首先发现利用植物组织培养技术可以无性繁殖兰科植物，随后该技术广泛应用于多种兰科繁殖，尤其是对人工培育杂交品种的繁殖；国内外研宄人员对白及也进行了广泛的离体培养研宄，主要使用的是固体培养基，袁宁利用白及种子进行无菌萌发(亦称为非共生萌发)，形成试管苗；田英翠等采用白芨幼根作为外植体诱导出白芨原球茎，杨俊慧等切取白芨无菌幼苗的茎尖诱导丛生芽，丛生芽生根培养为成株；朱玉球等则利用白芨种子萌发形成的原球茎作为外植体，诱导形成原球茎；余朝秀等利用栽培植株的茎尖及侧芽，诱导增殖芽形成根后移栽，试管苗成活率达90%以上；付志惠等对不同胚龄白芨种子的无菌播种技术进行了探索；Arditti描述了利用根尖(Root Tip)、莖节(Stem Node)及假鳞莖(Pseudobulb)离体培养，诱导不定芽发生进行离体繁殖。
[0009]利用植物组织培养技术进行白及快速繁殖是可行的，目前已经在生产上应用，但该技术存在以下不足之处:
[0010]1、需要较为复杂的技术条件；
[0011]2、无菌操作劳动强度大，并且人员需要技术培训；
[0012]3、试管苗驯化成活率低。
[0013]因此，利用植物组织培养技术进行白及快速繁殖的生产成本较高。而对兰科植物种子进行液体培养以形成原球茎有一些报道，包括Chu(2006)、Gangaprasad(2013)、Hsu (2012)、Popov (2004)、Pedroso (1992)、Popova (2003)、Hossain (2010)、Nhut (2005)、Minea (2004)、Paul (2012)、Nagananda (2012)、Thorpe (2011)，最近王楷等人(王楷，李玥，张云峰，田宝强，杨秀梅，普家宁，严胜柒.白芨种子的高效萌发及其无性繁殖体系的构建.云南师范大学学报(自然科学版)，2014，34 (4):71-78)对白及种子进行液体培养，结果显示添加1.0mg/L 6-BA的1/2MS液体培养基是种子萌发最佳培养基为；他们的工作主要是进行理论研宄，包括固体、液体培养基对比，种子活力检测、不同培养基的影响、不同发育状态种子萌发效应等，开展的研宄都是在较小体积的液体培养基中进行，种子萌发形成原球茎后，都没有将原球茎转入土壤基质培养成苗，从而形成大规模繁殖技术。
[0014]此外，与本发明相关的专利文献有:
[0015]1、白芨种茎的生产方法(申请号:201310579744.9)，
[0016]2、一种白芨种子的育苗方法(申请号:201210350910.3)，
[0017]3、白芨的种子组培繁殖方法(申请号:201310282939.7)，
[0018]4、利用白芨种子快速繁殖小苗的方法(申请号:200910102668.6)，
[0019]5、通过静态液体培养生产兰花实生苗的方法(美国:7073289),
[0020]上面5种方法都是采用白及成熟种子，进行无菌播种，即植物离体培养。
[0021]6、白及快速繁殖育苗的方法(申请号:201310152721.X)，
[0022]该方法需采用喷洒多菌灵和杀虫剂以抑制杂菌及害虫发生。
[0023]7、一种白及种子的繁殖方法(申请号:201310085109.5)，
[0024]该方法需对培养基质喷洒1/2MS无糖培养液，播种后需定时喷雾营养液(组分:6-苄氨基嘌呤O?2.0mg/L，1-萘乙酸O?1.0mg/L，溶剂为1/2MS或MS无糖培养液)。
[0025]可见，目前尚未见到利用白及种子在液体培养基中形成原球茎，再将原球茎播种到栽培基质中进行快速种苗繁殖的技术报道。
【发明内容】
[0026]为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用白及种子在无菌的液体培养基中培养形成原球茎，再将原球茎播种到栽培基质中继续培养快速繁殖白及种苗的方法，该方法对环境友好、工艺简单、育苗周期短，并且种子萌发率和成苗率均较高。
[0027]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案:
[0028]一种基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0029]Stepl:将白及种子消毒后无菌接种到液体培养基中，置于光照下静置培养，每10ml液体培养基中接种20mg白及种子；
[0030]St印2:待获得直径l_2mm的原球茎后，将原球茎取出培养基，冲洗后播种到经消毒处理、富含腐殖质的栽培基质中；
[0031]Step3:原球茎在栽培基质中萌发生长，待小块茎直径达0.5-2cm时即可用于销售或定植大田。
[0032]前述的基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，在Stepl中，对白及种子消毒所使用的消毒剂为70%酒精与0.1%取(:12或20%的次氯酸钠进行配合使用。
[0033]前述的基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，在Stepl中，前述液体培养基为MS培养基、B5培养基、N6培养基或Knudson培养基。
[0034]前述的基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，在Stepl中，光照下静置培养的培养温度为20-25°C，湿度为50% -90%，光照强度为3000-6000勒克斯。
[0035]前述的基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，在Step2中，前述土壤基质为泥炭与普通栽培土壤或自然土壤的混合物，前述泥炭的质量百分含量为20-50%。
[0036]前述的基于种子液体培养的快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于，在Step3中，原球茎在栽培基质中生长的初期用遮阴网遮阴，生根后逐渐增加光照强度，整个栽培过程中通过搭建塑料棚或者通过喷雾加湿保持栽培基质的含水量在75% -95%的范围内。
[0037]本发明的有益之处在于:
[0038](I)本方法不需要大量使用杀虫剂、灭菌剂，对环境友好；
[0039](2)生产工艺简单，在整个生产过程中仅需要一次无菌操作，使用液体培养基进行培养，避免了使用固体培养基带来的播种量小、需要多次继代培养、形成的幼苗根系相互缠绕、定植土壤时需要较多人工等问题，从而在总体上对