一种阳春秋海棠组织培养繁育方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于植物组织繁育领域，具体涉及一种阳春秋海棠组织培养繁育方法。
【背景技术】
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[0002]阳春秋海棠(Begonia coptidifolia)为秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属植物。仅分布于中国的广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区内的溪流边。秋海棠属植物一般为无裂叶或浅裂叶型，而阳春秋海棠叶片为深裂叶型，具有较高的观赏价值，且在系统学上占有重要地位。由于自然分布狭窄以及特殊的分布特点，野生阳春秋海棠居群数量极少。急需开展该种的保护和繁育工作。
【发明内容】
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[0003]本发明的目的是提供一种能快速，高效繁殖阳春秋海棠，从而使濒危植物阳春秋海棠得到保存和发展的阳春秋海棠组织培养繁育的方法。
[0004]本发明的阳春秋海棠组织培养繁育的方法，其特征在于，包括以下步骤
[0005]a、外植体及其处理:以阳春秋海棠(Begonia coptidifolia)的叶片作为外植体，将外植体进行消毒处理；
[0006]b、不定芽的诱导:将消毒处理后的外植体接种到诱导培养基上，培养条件为:22?28°C，黑暗培养或光照强度20 μ mo I IrTiV1以下，光照时间14小时/天，培养60天，然后转到光照强度40?100 μ mo I πΤΥ1，光照时间6?14小时/天，培养30天，得到不定芽；所述的诱导培养基每升含有激动素(KT)0.1?2.0mg或6-苄腺嘌呤(BA)0.1?2.0mg或N-苯基-K -1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ) 0.1?2.0mg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为MS培养基，ρΗ6.0 ；
[0007]c、继代繁殖:将不定芽转入繁殖培养基中培养，培养条件为:22?28°C，光照强度20?100 μ mo I n^s—1，光照时间14小时/天，所述的繁殖培养基每升含有6-节腺嘌呤(BA)0.1?1.5mg、α -萘乙酸(NAA)0.01?0.lmg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为MS培养基，pH6.0 ；
[0008]d、生根培养:将步骤c继代繁殖得到的不定芽转入至生根培养基中培养，培养条件为22?28 °C，光强为50?80 μ mo I JiT2S'光照时间6?14小时/天，使其生根，长成试管苗，所述的生根培养基每升含有吲哚-3-丁酸(IBA)0.05?0.2mg或α-萘乙酸(NAA) 0.05?0.2mg，以及还含有蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为1/2MS培养基，pH6.0 ；
[0009]e、试管苗的移栽:将试管苗移植到蛭石和沙石按体积比为1:1的基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养后获得栽培苗。
[0010]一个月后试管苗就可在基质中长到4?5cm高，期间每星期施1:1000复合肥(N:P:K = 1:1:1)，室外温度介于20-30°C，移栽成活率达到95%以上，能够保证很高的成活率，此时可以将小苗移栽到盆中培养，盆中只含有火灰。
[0011]所述的将外植体进行消毒处理优选是将阳春秋海棠叶片经自来水清洗干净后，先以体积分数75%酒精水溶液表面擦洗消毒10秒钟，无菌水洗脱2次，之后在质量分数0.1 %升汞水溶液中浸泡8分钟，并以无菌水洗涤3次，最后将叶片切成0.6cm2大小，接种至诱导培养基上。
[0012]所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看谭文澄、戴策刚主编，《观赏植物组织培养技术》，北京:中国林业出版社，1991，所述的1/2MS培养基是将MS中的大量元素和微量元素减半，其它成分不变而形成的培养基。
[0013]在离体培养条件下，培养基中植物生长调节剂对于细胞脱分化起关键性作用。本发明通过调整培养基内植物生长调节剂组分，能够有目的地诱导阳春秋海棠不定芽的形成。此外也可诱导根的发育，最终使试管苗能够发育成为完整的植株。移栽成活率达到95%以上，能够使阳春秋海棠这种濒危植物得以保存和发展，为今后更进一步利用该物种奠定良好的基础。
【具体实施方式】
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[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0015]实施例1:实验地点:中国科学院华南植物园组织培养室
[0016]本实施例的阳春秋海棠组织培养繁育的方法，其具体步骤如下:
[0017]a、外植体及其处理:从广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区内的溪水边采集到一株阳春秋海棠植株，取阳春秋海棠叶片，经自来水清洗干净后，先以体积分数75 %酒精水溶液表面擦洗消毒10秒钟，无菌水洗脱2次，之后在质量分数0.1%升汞水溶液中浸泡8分钟，并以无菌水洗涤3次，最后将叶片切成0.6cm2大小，得到消毒处理后的外植体。
[0018]b、不定芽的诱导:将消毒处理后的外植体接种到诱导培养基上，培养条件为:22 0C，黑暗培养，培养60天，然后转到光照强度40 μ mo I πΓΥ1，光照时间14小时/天，培养30天，得到不定芽；所述的诱导培养基每升含有激动素(KT)0.lmg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为MS培养基，pH6.0 (具体配置方法是将上述成分混合均匀，调pH值，然后灭菌备用，以下培养基的配置方法与此相同)；
[0019]c、继代繁殖:将不定芽转入繁殖培养基中培养，培养条件为:22 °C，光照强度10ymol IrT2S'光照时间14小时/天，所述的繁殖培养基每升含有6-节腺嘌呤(BA)0.lmg、α-萘乙酸(NAA)0.lmg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为MS培养基，ρΗ6.0 ;丛芽在繁殖培养基上培养每个月可增殖3.3倍；
[0020]d、生根培养:将步骤c继代繁殖得到的不定芽转入至生根培养基中培养，培养条件为22°C，光强为SOymol HT2s'光照时间14小时/天，使其生根，长成试管苗；所述的生根培养基每升含有吲哚-3- 丁酸(IBA)0.05mg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为1/2MS培养基，pH6.00
[0021]e、试管苗的移栽:将试管苗移植到蛭石和沙石按体积比为1:1的基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养后获得栽培苗；
[0022]试管苗移植一个月后就可在基质中长到4?5cm高，期间每星期施1:1000复合肥(N:P:K = 1:1:1)，室外温度介于20-30°C，移栽成活率达到95%以上，能够保证很高的成活率，此时可以将小苗(栽培苗)移栽到盆中培养，盆中只含有火灰。
[0023]实施例2:实验地点:阳春市鹅凰嶂自然保护区内
[0024]本实施例的阳春秋海棠组织培养繁育的方法，其具体步骤如下:
[0025]a、外植体及其处理:从广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区内的溪水边采集到一株阳春秋海棠植株，取阳春秋海棠叶片，经自来水清洗干净后，先以体积分数75 %酒精水溶液表面擦洗消毒10秒钟，无菌水洗脱2次，之后在质量分数0.1%升汞水溶液中浸泡8分钟，并以无菌水洗涤3次，最后将叶片切成0.6cm2大小，得到消毒处理后的外植体。
[0026]b、不定芽的诱导:将消毒处理后的外植体接种到诱导培养基上，培养条件为:28°C，光照强度20 μπιο? HT2iT1以下，光照时间14小时/天，培养60天，然后转到光照强度80 μ mo I n^s—1，光照时间6小时/天，培养30天，得到不定芽；所述的诱导培养基每升含有激动素(KT) 2.0mg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为MS培养基，pH6.0 ；
[0027]c、继代繁殖:将不定芽转入繁殖培养基中培养，培养条件为:28°C，光照强度20 μ mo I πΓΥ1，光照时间14小时/天；所述的繁殖培养基每升含有6-节腺嘌呤(BA) 1.5mg、α-萘乙酸(應4)0.011^、蔗糖308、琼脂68，其余成分为1^培养基，？册.0;丛芽在繁殖培养基上培养每个月可增殖5.5倍；
[0028]d、生根培养:将步骤c继代繁殖得到的不定芽转入至生根培养基中培养，培养条件为28°C，光强为80 μπιο? HT2s'光照时间6小时/天，使其生根，长成试管苗；所述的生根培养基每升含有吲哚-3-丁酸(IBA)0.2mg、蔗糖30g、琼脂6g，其余成分为1/2MS培养基，pH6.00
[0029]e、试管苗的移栽:将试管苗移植到蛭石和沙石按体积比为1:1的基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养后获得栽培苗；
[0030]试管苗移植一个月后就可在基质中长到4?5cm高，期间每星期施1:1000复合肥(N:P:K = 1:1:1)，室外温度介于20-30°C，移栽成活率达到95%以上，能够保证