利用生物相容性颗粒保存细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料学领域，具体涉及利用生物相容性颗粒保存细胞的方法；特别是涉及在非低温冻存条件下，在不同温度、不同恶劣程度下，用对细胞无害的纯物理方法保存、运输活细胞的方法。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的发展，将从组织分离出的细胞用于测试、检测，是生物技术相关领域中非常重要的部分。分离出的细胞广泛用于病原体的检验、疾病的探查、病情的诊断、新药的试验以及动植物检疫、环境污染物质的检验等等。但是，绝大部分细胞在活体中都是由三维组织基质包裹存活的，如图la，微观上来看，细胞周围需要有组织基质的高分子所缠绕，细胞才能依附于基质存活。一旦细胞从活体中取出，脱离组织基质的包裹，在非低温的条件下，没有培养基底支持，都会死亡，如图lc。另外在生物技术领域中涉及的的细胞种类极其丰富，细胞存活能力也不同。因此，需要一种有效的细胞保存方法，使细胞脱离组织包裹后，在可能导致细胞活力下降或丧失的环境中，能较长时间并且高效的保持细胞存活力。
[0003]细胞在液氮中(零下196°C )冻存是目前用于细胞保存的主要方法，但是液氮冻存不仅步骤繁琐，还需要使用具有毒性的冻存剂(比如二甲基亚砜，甘油等)以及特殊仪器(液氮罐，梯度冻存盒等)。因此，寻找一种有效的在非低温条件下(例如生理温度或仅仅是常温)的细胞保存方法已成为各种生物技术领域中细胞应用的重大挑战。主要原因有以下几点:1)在很多基于细胞的应用(例如原位细胞诊断、药物筛选等)中，要求细胞在足够长的时间内保持它们的存活力和活性来完成检测，而有些特殊细胞在离开体内、脱离组织包裹后仅仅2小时就会死亡，这就急需一种在非低温检测条件下可以延长它们存活时间的保存方法；2)对于一些冷冻保存存活率较低的细胞，比如心肌细胞，一般采用4°C保存，但需要严格控制保存温度；并且由于心肌细胞已脱离组织包裹，因此只能在很短时间内有效的保存；3)在医疗条件较差且地理位置偏远的地区，没有常规的低温贮藏设备以及经过相关技术训练的人员，细胞标本需要数天或数周才能运送到有检测条件的医疗中心，因此需要一种在普通条件下就能够简便操作而又有效的细胞保存和运输方法。而在目前的细胞运输中，一般采用将处于对数生长中晚期的细胞贴壁生长于培养瓶中运输的方式。但这种方式由于在运输过程中，培养瓶中的贴壁细胞非常容易脱落而导致其死亡。为了防止细胞脱落，目前通常采用将培养瓶置于塑料泡沫或气泡衬垫中等方法减少运输途中对培养瓶的颠簸，但这些方法较为繁琐而效果又很有限。另外，细胞在运输过程中因过度繁殖、迅速将培养基消耗殆尽等原因而最终死亡，因此限制了运输时间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是，由于细胞脱离活体组织包裹后快速死亡，针对现有技术中非低温条件细胞保存方法的繁琐和效率低下、细胞运输的方法短缺等不足，首次利用生物相容性材料的颗粒物理方法堆砌包裹细胞，在非冻存的条件下，为细胞创造了一种模拟组织基质的三维环境来包裹细胞，使细胞感觉到仿佛仍在组织中“被保护”的安全环境，有效的使细胞存活，另外本方法无论是包裹细胞还是分离细胞都是不需要添加有毒化学物质的纯物理过程，提供一种简便而又高效的非低温保存的方法；同时，在不同温度(常温、生理温度等)、不同二氧化碳浓度(5%、大气浓度等)条件下也具有强大的保存能力，提供一种适宜和便利的细胞运输方法。
[0005]本发明的利用生物相容性颗粒保存细胞的方法，技术方案如下:
[0006]一种利用生物相容性颗粒保存细胞的方法，将纯生物相容性材料的水凝胶颗粒与细胞物理混合并离心富集，用水凝胶颗粒堆积将细胞包裹。
[0007]利用磁性纳米粒子的生物相容性颗粒保存细胞的方法，将加有磁性纳米粒子的生物相容性材料的水凝胶颗粒与细胞物理混合并离心富集，用有磁性纳米水凝胶颗粒堆积将细胞包裹；需要分离时，用磁分离将磁性生物相容颗粒分离获得需要的细胞。
[0008]所述生物相容性材料颗粒为1nm?1000 μ m ;将相容性颗粒与细胞以任意适宜比例均匀混合，并500?2000rpm离心富集保存。
[0009]所述生物相容性材料是任意有生物相容性质的天然或人工合成的高分子材料。
[0010]针对不需要分离生物相容性颗粒和细胞的应用，将纯生物相容性材料的水凝胶颗粒与细胞物理混合并离心富集，用水凝胶颗粒堆积将细胞包裹。如细胞检测等，颗粒对细胞达到长时间的保存效果，保证检测的顺利完成。
[0011]针对需要分离生物相容性颗粒和细胞的应用，将加有磁性纳米粒子的生物相容性材料的水凝胶颗粒与细胞物理混合并离心富集，用有磁性水凝胶颗粒将细胞包裹。如细胞运输等，等到运输到适宜地点，用磁分离将磁性生物相容颗粒分离获得需要的细胞，如图示2。
[0012]本发明提供的细胞保存方法有如下几个特点:(I)本发明取生物相容性颗粒，可以用纯物理的方法堆砌出一种由颗粒组成的三维环境，来保存从组织中取出而不能独立存活的细胞，保存效率极高，在细胞应用的一些情况下，比如细胞检测时，需要一段时间维持细胞活力，可以用生物相容性颗粒来维持细胞活力使细胞顺利完成检测，而同时生物相容性颗粒又不会由于影响细胞的正常功能比如分泌蛋白等而影响检测；(2)如果需要分离出颗粒获得细胞，可用简便无害的磁分离方式就能快速将加有磁性粒子的生物相容性颗粒分离出来，不需要化学物质降解，并且磁性颗粒可以回收再利用；(3)在不同温度，没有恒定二氧化碳浓度的环境下依然具有强大的保存细胞的能力，这不仅为许多不能低温冷冻保存的细胞提供了一种新型、有效的保存方法，而且为在恶劣环境下的细胞运输提供了一种适宜、方便、高效的运输技术。
[0013]本发明的创新性如下:1)本发明所提供的基于生物相容性颗粒构建细胞生存微环境的细胞保存方法还未见报道，无论是利用纯生物相容性颗粒保存细胞，还是利用磁性生物相容性颗粒保存和分离出细胞，其意义都在于纯物理的方法避免细胞受到化学试剂的损害，细胞存活率更高，分离和保存都简便易行；2)本发明不仅在生理温度(37°C )下有高效的保存效果，在常温(25°C )和冰箱温度(4°C )下依然具有强大的保存能力，同时在5%的CO2浓度(二氧化碳培养箱)和大气的浓度条件下也都可以有效的使细胞存活，其意义在于为恶劣条件下的细胞检测，细胞运输，提供一个简便而有效的保存方法。
[0014]本发明生物相容性颗粒保存细胞的关键步骤如下:(I)选取生物相容性材料颗粒(1nm?100 μ m)，生物相容性材料可以是任意有生物相容性质的天然或人工合成的高分子材料，例如:天然产物如壳聚糖、葡聚糖、胶原、纤维素、淀粉、透明质酸、海藻糖、海藻酸盐、明胶等，人工合成材料如聚乙二醇、聚羧基甜菜碱、聚磺基甜菜碱、聚磷酸胆碱、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等；将相容性颗粒与细胞以任意适宜比例均匀混合并500?2000rpm离心富集保存；
[0015]本发明磁性生物相容性颗粒保存细胞的关键步骤如下:(1)选取磁性生物相容性材料颗粒(1nm?1000 μπι)，磁性粒子可以是任意有磁性的纳米粒子，生物相容性材料可以是任意有生物相容性质的天然或人工合成的；将相容性颗粒与细胞以任意比例均匀混合并500?2000rpm离心富集保存；(2)将细胞与磁性颗粒再悬浮，磁铁将颗粒吸走后获得细胞。
[0016]本发明为了解决现有技术中保存以及运输细胞的不足之处，首次采用非低温环境下，生物相容性材料的颗粒堆积保存细胞的方法，如图lb，细胞周围是生物相容性的颗粒来模拟组织包裹环境。生物相容性材料的水凝胶由于具有模拟组织三维网状结构的性质，因此已被成功应用于模拟组织包裹细胞的组织工程领域中。而本发明利用的正是生物相容性材料的颗粒来模拟组织包裹细胞，使细胞感受到仿佛仍生长于组织的三维包裹环境中，并且在非低温环境下细胞仍能较长时间存活。另外，本发明的另一个优势是，无论是包裹还是分离出细胞都是利用对细胞毫无危害作用的纯物理方法，此物理方法无害、高效而又简便，大大优于直接用有毒的化学试剂交联将细胞包裹在生物相容性水凝胶中来模拟组织的方法；在恶劣环境，不同温度，不同CO2浓度条件下依然对细胞有强大的维持细胞活性能力，以适应不同恶劣环境下的运输条件和检测条件。本发明所提供的细胞保存的方法是一种长效、简便、无害的纯物理方法，基于生物相容性颗粒构建细胞生存微环境的细胞保存方法还未