用于生成治疗性蛋白质的植物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/790, 850和2012年 11月1日提交的美国临时申请序列号61/721，194的优先权。
技术领域
[0003] 本文涉及用于制备植物的材料和方法，所述植物适用于生成用于给予人和动物的 治疗性蛋白质，具体而言是通过在编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因中进行靶向 敲除。本文还涉及缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性或者具有降低的木糖基转移酶 和岩藻糖基转移酶活性的烟草（Nicotiana)品种。
【背景技术】
[0004] 与动物糖蛋白不同，植物糖蛋白具有0 (1，2)木糖基和核心-a (1，3)岩藻糖基残 基，且缺少末端0 (1，4)半乳糖基残基和唾液酸。0-1，2-木糖基转移酶（"XylT"）催化 木糖从UDP-木糖转移至蛋白质连接的N-聚糖的核心连接的甘露糖。该酶是植物和 一些非脊椎动物物种特有的，且不存在于人或其他脊椎动物中。a -1. 3-岩藻糖基转移酶 ("FucT"）催化岩藻糖从⑶P-岩藻糖转移至蛋白质连接的N-聚糖的核心|3 -连接的N-乙 酰葡糖胺（GlcNAc)。该酶发现于植物和动物物种（包括人）中。
【发明内容】
[0005] 本文提供了用于制备植物的材料和方法，所述植物特别用于生成适用于给予人和 动物的治疗性蛋白质，具体而言是通过在编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因中进 行靶向敲除。本文还提供了烟草（Nicotiana)品种，其与对照烟草品种相比缺失木糖基转 移酶和岩藻糖基转移酶活性或者具有降低的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性。
[0006] 本发明至少部分基于以下发现，即可通过敲除编码木糖基转移酶和岩藻糖基转 移酶的基因的所有拷贝来制备适用于生成用于给予人和动物的蛋白质的植物。本发明 还至少部分基于缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的本赛姆氏烟草（Nicotiana benthamiana)品种的开发。能够制备缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的可存活植 物可促进用于给予人和动物的治疗性蛋白质的生成，其与具有木糖基转移酶和岩藻糖基转 移酶活性的植物中生成的蛋白质相比免疫原性或过敏性反应的发生率较低。
[0007] 此外，本发明还至少部分基于：可通过使编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的 基因的一个或多个拷贝敲除或突变来制备适用于生成用于给予人和动物的蛋白质的植物， 从而使基因的转录和/或所编码多肽的翻译与相应野生型植物或植物细胞相比下降的发 现，并且至少部分基于具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的本赛姆氏烟草品 种的开发。能够制备具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的可存活植物也可促 进用于给予人和动物的治疗性蛋白质的生成。植物生成的蛋白质中聚糖水平的降低可从该 蛋白质去除一些植物特有的特性。与不具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的 植物所生成的蛋白质相比，这类蛋白质具有较低的免疫原性或过敏性反应发生率。与不具 有降低的聚糖水平的蛋白质相比，这类蛋白质还具有改善的功能活性。
[0008] 在一个方面，本文涉及一种烟草植物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一 个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变，其中该植物或植物细胞 在该植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的0 -1，2-木糖 基-糖或核心a-1，3-岩藻糖基-糖。该突变可以位于SEQ ID NO: 1、2或3中所列的一条 或多条序列处。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶（rare-cutting endonuclease) 诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是转录激活因子样（TAL)效应子核酸内切酶。该 TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID N0:45-63中任一项所列序列。该植物或植物细 胞可包含编码异源多肽的核酸。该突变各自可以是多于一个的核苷酸的缺失。多个XylT 等位基因和多个FucT等位基因中的每一个都可以具有内源核酸序列的缺失且不包含任何 外源核酸。该植物或植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物或植物细胞。
[0009] 在另一个方面，本发明涉及一种生成多肽的方法。该方法可包括（a)提供烟草植 物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的 每一个中都具有突变，该植物或植物细胞在该植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖 结构上不生成可检测水平的0 -1，2-木糖基-糖和核心a -1，3-岩藻糖基-糖，且该植物 或植物细胞含有核酸，该核酸包含（i)编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地 连接于（ii)植物可表达启动子，和（iii)涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多 肽对所述植物是异源的；以及（b)在足以生成异源多肽的条件下使该植物或植物细胞生长 足以生成异源多肽的时间。该方法还可包括从所述植物或植物细胞中分离该异源多肽。该 突变可已被一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效 应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID N0:45-63中任一项所列序 列。
[0010] 在另一个方面，本文涉及一种制备烟草植物的方法，该烟草植物在多个XylT等位 基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变。该方法可包 括（a)使具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与靶向内 源性XylT序列的一种或多种稀切核酸内切酶和靶向内源性FucT序列的一种或多种稀切核 酸内切酶接触，（b)从该群体中选择特定细胞，其中多个XylT等位基因和多个FucT等位基 因已失活，以及（c)将所选植物细胞再生为烟草植物，其中该烟草植物在多个XylT等位基 因中含有突变且在多个FucT等位基因含有突变，且在该植物所生成的糖蛋白的N-聚糖结 构上不生成可检测水平的0-1，2-木糖基-糖或核心a-1，3-岩藻糖基-糖。该烟草植物 细胞可以是原生质体。该方法可包括使用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载 体转化原生质体。所述一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL 效应子核酸内切酶各自可靶向SEQ ID N0:45-63中任一项所列序列。该方法可包括向原生 质体内导入TAL效应子核酸内切酶蛋白。该方法还可包括培养原生质体以生成植物株系。 该方法可包括从原生质体中分离包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的 基因组DNA。该烟草植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物细胞。
[0011] 在另一个方面，本文涉及一种生成烟草植物的方法，该烟草植物在多个XylT等位 基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变。该方法可包 括（a)将在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有突变的 第一烟草植物与在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有 突变的第二烟草植物杂交以获得后代，以及（b)从后代中选择在多个XylT等位基因中具有 突变且在多个FucT等位基因中具有突变的烟草植物。该突变可以由一种或多种稀切核酸 内切酶诱导。所述一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。所述TAL效 应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID N0:45-63中任一项所列序列。该突变各自可以是多于 一个核苷酸的缺失。该后代可以是各所述等位基因上突变的纯合子。
[0012] 本文还涉及一种烟草植物或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因上具有突 变且在一个或多个FucT等位基因上具有突变，其中，与不含有所述突变的相应植物或植物 细胞相比，该植物或植物细胞中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的0 -1，2-木糖基-糖 和核心a-1，3-岩藻糖基-糖的水平降低。该突变可位于SEQ ID NO: 1、2或3中所列的一 条或多条序列处。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸 内切酶可以是转录激活因子样（TAL)效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可 结合SEQ ID N0:45-63中任一项所列序列。该植物或植物细胞可含有编码异源多肽（如重 组多肽）的核酸。该突变各自可以是多于一个核苷酸的缺失。一个或多个XylT等位基因 和一个或多个FucT等位基因中的每一个都可以具有内源核酸序列的缺失且不包含任何外 源核酸。该植物或植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物或植物细胞。
[0013] 在另一个方面，本文涉及一种生成多肽的方法。该方法可包括（a)提供烟草植物 或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中 具有突变，其中，与不含有所述突变的相应植物或植物细胞相比，该植物或植物细胞中生成 的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的0-1，2-木糖基-糖和核心a-1，3-岩藻糖基-糖的水 平降低，且该植物或植物细胞含有重组核酸，该重组核酸包含（i)编码多肽的核苷酸序列， 所述核苷酸序列可操作地连接于（ii)植物可表达启动子，和（iii)涉及转录终止和聚腺苷 酸化的序列，其中所述多肽对所述植物是异源的；以及（b)在足以生成异源多肽的条件下 使该植物或植物细胞生长足以生成异源多肽的时间。该方法还可包括从所述植物或植物细 胞中分离该异源多肽。该突变可已被一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切 核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。
[0014] 在另一个方面，本文涉及一种制备烟草植物的方法，该烟草植物在一个或多个 XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中具有突变。该方法可包括（a)使 具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与靶向内源性XylT 序列的一种或多种稀切核酸内切酶和靶向内源性FucT序列的一种或多种稀切核酸内切酶 接触，（b)从该群体中选择特定细胞，其中一个或多个XylT等位基因和一个或多个FucT等 位基因已失活，以及（c)将所选植物细胞再生为烟草植物，其中该烟草植物在一个或多个 XylT等位基因中含有突变且在一个或多个FucT等位基因中含有突变，且与不含有所述突 变的植物相比，该烟草植物所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的0 -1，2-木糖基-糖和 核心a-1，3-岩藻糖基-糖水平降低。该烟草植物细胞可以是原生质体。该方法可包括使 用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载体转化原生质体。该一种或多种稀切 核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可靶向SEQ ID N0:45-63中任一项所列序列。该方法可包括向所述原生质体内导入TAL效应子核酸内切 酶。该方法还可包括培养所述原生质体以生成植物株系。该方法可包括从原生质体中分离 包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因组DNA。该烟草植物细胞可 以是本赛姆氏烟草植物细胞。
[0015] 在另一个方面，本文涉及一种生成烟草植物的方法，该烟草植物在一个或多个 XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中具有突变。该方法可包括（a) 将在至少一个XylT等位基因中含有突变且在至少一个FucT等位基因中含有突变的第一烟 草植物与在至少一个XylT等位基因中含有突变且在至少一个FucT等位基因中含有突变的 第二烟草植物杂交以获得后代，以及（b)从后代中选择在一个或多个XylT等位