特别地，其可以修改生物体的控制特性以增加其对环境刺激的反应性（Pfaff et al. (2008))。因此，为了证实本方法，询问光遗传提高的皮质醇水平是否可以修改幼体斑马 鱼对外部刺激的反应性。为了检验这个预测，测量个体幼体对高度控制的温度变化的反应 (图2a_c);温度用作外部输入源，因为幼体斑马鱼是严格放热的，并且它们的运动行为随 温度变化而增加（Prober et al. (2008))。蓝光刺激之后不久，阳性而不是阴性幼体快速反 应以通过增加它们的转弯（未示出）和游泳速度（图2d)来与升高的温度接触。这导致刺 激反应性的显著组差异（图2e)。为了排除刺激特异性，然后表征迄今未报道的幼体斑马鱼 对细微机械感觉刺激（SMS)的应答。然后，测量光诱导的应答增强。观察到幼体斑马鱼对 SMS应答，接近刺激源，随后逐步减少它们不连续运动的速率（图2f-h)，这是分级（图2i)、 主动和非应激性（图7a，b)的应答。低强度的蓝光暴露在阳性幼体中特异性地增强SMS反 应性，而较高的光强度在两组中均大大增强反应性（图2j)，表明这个应答是对应激高度敏 感的。总的来说，这些结果证实光遗传提高的皮质醇水平增强幼体斑马鱼中的刺激反应性， 可能是通过改变应答阈值（图2k)。
[0141] 已知GC介导快速应激反应（Moore and Orchinik (1994))，但是它们的效应却难 以分析，因为注射外源性GC是应激性的，并且不提供足够的分辨率。为了检测快速GC效应 是否可以在运动上检测，首先测试短暂的光刺激是否足以增加皮质醇。短暂暴露于仅持续 几秒的低强度蓝光足以在阳性而不是阴性幼体中增加皮质醇，并且刺激越长，随后的皮质 醇水平越高。相比之下，较高的光强在两组中均增加皮质醇，但是bPAC-阳性幼体表现出 比阴性幼体高的水平；如前所述，刺激越长，皮质醇水平越高（图3a)。令发明人惊讶的是， bPAC-阳性和阴性幼体在蓝光暴露期间已不同移动，阳性幼体随着光强的增加表现出相对 较低和较高的运动水平（图3b，c)。这些结果显示升高的皮质醇水平具有快速的可检测的 活动性变化，并且这些变化可以具有不同标志，这取决于皮质醇变化率。
[0142] 应激提高GC-水平，但是通过GC负反馈至下丘脑和垂体终止应激应答（Dallman et al.(1994);Dallman，and Yates(1969))。如库欣综合征中，ACTH 和 GC 过量引起 的这类负反馈的损伤可以导致hypercortisolaemia状态，这是人中的主要健康风险 (Wolkowitz et al. (2009))。库欣病样皮质醇增多症可以在斑马鱼中通过祀向促肾上 腺皮质激素细胞肿瘤生长和激素分泌来模拟（Liu et al. (2011))，但是这种方法不允许 hypercortisolaemia的时间控制。因此询问在垂体水平修改HPI-轴的获得是否可以导 致hypercortisolaemia的形式。单一蓝光暴露之后20分钟，bPAC-阳性和阴性幼体具 有显著降低的皮质醇水平，40分钟后其达到基础水平（图8)。形成鲜明对比的是，阳性 而不是阴性幼体对重复的光暴露应答，具有增加的皮质醇（图3d)。然后检测这种形式的 hypercortisolaemia怎样关系到幼体的运动行为，并且观察到bPAC-阳性幼体在光偏移之 后数十分钟表现出增强的运动（图3e)。对来自几次暴露的皮质醇水平作图，所得的运动值 可以通过线性回归近似计算（图3f，R_squared = 0. 97)。这些数据证实，在重复暴露于蓝 光的动物中，在垂体水平增加HPI-轴的获得导致hypercortisolaemia和偏离标称运动。
[0143] 以前存在的不能以高时间分辨率改变内源性GC-水平使得难以确定GC在调节 应激反应中的具体作用。在这个实施例中显示在幼体斑马鱼中可以光遗传修饰它们的 HPI-轴的获得，改变内分泌和行为应激反应。斑马鱼具有许多遗传工具，并且幼体的半透明 身体及其卵生发育使得其对于非侵入性脑成像和神经回路的光遗传研宄是理想的。这个研 宄提出一种分析GC-功能的有前途的新方法，包括应激轴内的反馈和发育编程。
[0144] 实施例3:幼体斑马鱼中对应激物的直接应答
[0145] 凭经验地，应激物是这样的刺激，其导致垂体细胞释放ACTH，随后触发肾上腺皮质 中的细胞释放糖皮质激素。在成年硬骨鱼中，温度、盐度、浊度、重金属和pH的变化提高糖 皮质激素水平（Wendelaar Bonga, 1997)。以前（未公开）的数据显示在幼体斑马鱼中各种 应激物也提高全身皮质醇水平。周围培养基的机械感觉波动、渗透休克、温度变化、氨、硫酸 铜（CuS04)和乙醇全部导致相对于对照升高的皮质醇水平。
[0146] 如图10中所示，在暴露于渗透休克的幼体斑马鱼中观察到应激物强度依赖性皮 质醇增加（图l〇a)，并且在应激物暴露之后可以看到峰后皮质醇下降（图IOb)。第二应激 物，即机械感觉输入进一步用来精确控制应激物强度。这里，使用培养基的分级波动，其使 用压电元件以产生精确振动，不同于以前采用的旋转。与渗透休克上的结果一致，皮质醇表 现出与机械感觉输入的应激物强度的正相关（图IOc ;F(3, 44) = 7. 64, p〈0. 001)。还可以 证实暴露之后皮质醇水平随时间衰减（图l〇d ;F(2, 14) = 20. 19, p〈0. 001)。应激物暴露 之后30min，在渗透休克和机械感觉输入这两种情况下，不可以区分峰后皮质醇水平与初始 基础水平（具有灰色区域的虚线）。
[0147] 实施例4 :应激物暴露可逆地减少幼体的摄食动机
[0148] 脊椎动物中公知的行为应激应答是食物摄取的减少（Carr, 2002)。在斑马鱼发育 中，在3dpf左右卵黄囊开始耗尽（Ki_el et al.，1995)，幼体需要开始主动摄食。因此，问 题出现了，这种现象是否也可以在发育的斑马鱼中找到。为了解决这个问题，将幼体斑马鱼 暴露于应激物，随后测试它们的摄食动机。
[0149] 首先，需要开发摄食动机的度量。这通过间接评价摄食动机为两隔室游泳室中的 差异空间使用来实现，其中仅在一个隔室中提供食物（图l〇a)。在4dpf不可以检测到偏好， 而在5和6dpf，朝向食品的侧偏是显著的。总体摄食动机随年龄显著增加（图IOb ;AN0VA F(2, 61) = 8. 50, p<0. 001) 〇
[0150] 为了测试应激物暴露的效应，将6dpf幼体用以前发现提高皮质醇水平的机械感 觉输入处理（见实施例3)。处理完全破坏侧偏好，表明摄食动机的减少（图lie)。这种效应 是可逆的，因为当应激物暴露之后给出60min恢复时，幼体表现出与未处理的对照不可区 分的摄食动机。总的来说，处理的效应是高度显著的（ANOVA F(2,68) = 16. 56，p〈0.001)。 为了排除应激物特异性现象的可能性，还测试了暴露于渗透休克。结果证实以前的结果， 表现出最初减少的摄食动机，在应激物暴露之后60min重新获得摄食动机（图4d ;AN0VA F (2, 22) = 5. 79, p = 0? 010)。
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