一种显著提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于细胞工程组织培养技术领域，特别涉及一种显著提高黄菖蒲愈伤组 织诱导率的方法。
【背景技术】
[0002] 黄菖蒲为鸢尾科（Iridaceae)鸢尾属（Iris)多年生草本植物，花期4-6月，花色 黄艳，叶剑形，青翠碧绿，具有很高的观赏价值。园林应用中黄菖蒲多作挺水植物，但研究表 明其生态适应性强，也可旱生、湿生栽培（韩玉林等，2006)。黄菖蒲抗性强，可耐盐碱，对水 体中的重金属离子和有机污染有一定的吸收能力。
[0003] 黄菖蒲属于二倍体，且较鸢尾属其他植物繁殖能力强，将其作为模式植物开展研 究可为鸢尾属植物的遗传育种提供理论依据。转基因技术可定向改良植物性状，该技术在 鸢尾属植物中应用较少，目前对其他观赏植物的遗传转化，大多是对其愈伤组织进行转化， 然后筛选、分化，从而获得转基因植株。因此，愈伤组织的获得是最终获得转基因植株的关 键。此外，愈伤组织也可用于植物种质资源保存与快繁生产。
[0004] 目前鸢尾属植物通常使用花器官、幼叶、茎尖等部位作为外植体进行愈伤组织 诱导，其中以日本花菖蒲花茎为外植体，污染率15 %，成活率75 %，愈伤组织诱导率仅 59. 09%，以路易斯花器官为外植体，花轴的愈伤诱导率最高，但也仅为57. 2%，以德国鸢尾 花器官为外植体，污染率为26. 7%，死亡率为6. 7%，愈伤诱导率仅45. 57% (王文元等， 2012 ;吴月燕等，2009 ;陈晨等，2010)，均存在污染率高，愈伤诱导率低等问题。公开号为CN 101816287的中国专利文献公开了一种采用悬浮培养法保存黄菖蒲愈伤组织的方法，通过 建立悬浮培养，愈伤组织不断增殖，形成很多小块的愈伤组织，使愈伤组织数量迅速扩大。 但悬浮培养需使用摇床，消耗能源，且过程繁琐，后期进行转基因或快繁操作时需使用尼龙 膜过滤后将大块愈伤组织转接至固体培养基上备用，过多的中间过程很可能导致愈伤材料 污染。此外，黄菖蒲成熟种子存在休眠，会严重降低愈伤组织诱导率，延长愈伤诱导时间。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能显著提高黄菖蒲愈伤 组织诱导率的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
[0006] 提供一种显著提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法，包括培养基的配置，所述显著 提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法具体包括下述步骤：
[0007] (1)材料采取：
[0008] 在黄菖蒲花期后40~60天，取（发育良好的）蒴果置于封口袋中，于4°C冰箱中 冷藏3~5天后，进行后续操作；
[0009] (2)愈伤诱导培养基配置：
[0010] 配置愈伤诱导培养基的培养基溶液，然后将配置好的培养基溶液在121°C高压下 灭菌15~20min后，在超净工作台上分装于经高压灭菌过的玻璃培养皿中，待培养基凝固 后，用保鲜膜或锡纸包好，放在无菌环境中存放待用；
[0011] 所述愈伤诱导培养基为含 30g/L鹿糖、3g/L Phytagel、0 ~0· 2mg/L KT(Kinetin， 6-呋喃甲基腺嘌呤）、0~L 0mg/L6-BA (6-Benzyladenine，6-苄氨基腺嘌呤）和0~ 2. 0mg/L2, 4-D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid，2, 4_ 二氣苯氧乙酸）的 MS 培养基，且培 养基溶液的pH值为5. 8~5. 9 ;
[0012] (3)外植体消毒：
[0013] 将步骤（1)中冷藏过的蒴果，在添加（少量）洗洁精和TWEEN-20的自来水中浸泡 15~20min，再在流水下冲洗0. 5~lh，然后在超净工作台上进行消毒处理；
[0014] (4)外植体接种及愈伤组织诱导：
[0015] 将步骤（3)处理后的蒴果，放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实 纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上；（操作人员带上一次性PE手套）沿种子 纵轴方向轻轻撕开，即可看到白色的嫩胚，然后将种子暂放于经高压灭菌的空培养皿中，用 镊子慢慢将胚取出接种至步骤（2)中制备的愈伤诱导培养基表面；再将接种了外植体的培 养基在25摄氏度、黑暗条件下培养7~10天，出现愈伤组织团块；
[0016] (5)胚性愈伤组织的诱导：
[0017] 外植体在愈伤诱导培养基上培养20天后，部分幼胚顶端膨大并长出金黄色的愈 伤组织团块，部分幼胚顶端愈伤组织为褐色水渍状并逐渐萎蔫；用解剖刀将幼胚顶端金黄 色的愈伤组织团块切下，转接到最佳的愈伤诱导培养基上，在25摄氏度、黑暗条件下继续 培养，用于后期研究；
[0018] 所述最佳的愈伤诱导培养基具体是指含30g/L鹿糖、3g/L Phytagel、0· 2mg/L KT 和2. Omg/L 2, 4-D的MS培养基。
[0019] 作为进一步的改进，所述步骤（I)中，所取的蒴果为长7~10cm的蒴果。
[0020] 作为进一步的改进，所述步骤（3)中，消毒处理具体为：先将蒴果浸入体积浓度为 70%酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0022] 1、本发明以黄菖蒲幼嫩胚为外植体，具有污染率低、材料易得的特点，其突出优势 在于愈伤诱导效率高、外植体幼嫩少病毒、操作简便、获得的愈伤胚性好。
[0023] 2、黄菖蒲自然结实率高，每个果荚内有种子50-80粒，取材方便，花后40-60天时 种子尚未成熟，沿种子纵轴轻撕即可获得幼嫩胚操作极为简便，大大地减少了对植株本身 的破坏，也不影响其观赏效果。
[0024] 3、本发明所用方法，污染率可降低为0,可获得高达83. 3%~100%的愈伤诱导 率，切除顶端愈伤组织的嫩胚二次诱导仍可获得高达80%的愈伤诱导率；通过对幼嫩胚诱 导出的愈伤组织进行筛选，可保证愈伤组织良好的胚性，有利于后期愈伤组织的保存或用 于遗传转化体系、种苗快繁。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述：
[0026] 下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方 式限制本发明。
[0027] 在本发明中，MS培养基购自Phyto Technology Laboratories公司，规格为50L ; MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，适用范围比较广，多数 植物组织培养快速繁殖均可用它作为培养基的基本培养基。Phytagel (植物凝胶）购自 Sigma公司，规格为100g，在植物组织培养过程中用来凝固培养基，使用方便，对培养植物 不产生不利影响，具有较好的透明度。Kinetin (KT，6-呋喃甲基腺嘌呤）购自北京鼎国昌盛 生物技术有限责任公司，由Sigma公司产品分装，规格为lg。
[0028] 6-Benzyladenine(6-BA，6-苄氨基腺嘌呤）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责 任公司，规格为l〇g，二者均为细胞分裂素类植物生长调节剂，主要功能是促进细胞分裂， 抑制衰老。2,4-0;[(311101'(^11611(?5^061:;^&(^(1(2,4-0,2,4-二氯苯氧乙酸）购自？1171:0 Technology Laboratories公司，规格为10mg/mL，100mL，是一种生长素类植物生长调节剂， 主要功能是促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导愈伤组织形成。
[0029] 实施例1
[0030] 步骤一：材料采取：
[0031] 在黄菖蒲花期后50天，取发育良好的蒴果（长约8-lOcm)，置于封口袋中于4°C冰 箱中冷藏4天后，进行后续操作。
[0032] 步骤二：愈伤诱导培养基配置：
[0033] 愈伤诱导培养基为含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel和其余添加物的MS培养基，具体 的其余添加物配方见表1，且培养基溶液的pH值为5. 85。
[0034] 将配置好的培养基溶液121°C高压灭菌ISmin后，在超净工作台上分装于经高压 灭菌的玻璃培养皿中，待培养基凝固后，用保鲜膜或锡纸包好，放在无菌环境中存放待用。
[0035] 步骤三：外植体消毒：
[0036] 将步骤一中冷藏过的荚果在添加洗洁精和少量TWEEN-20的自来水中浸泡18min， 再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒。
[0037] 消毒方法如下：将蒴果浸入体积浓度为70%的酒精溶液后，置于酒精灯火焰上灼 烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
[0038] 消毒后进行接种：将蒴果放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵 棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上。操作人员带上一次性PE手套，沿种子纵轴 方向轻轻撕开即可看到白色的嫩胚，此时可将种子暂放于经高压灭菌的空培养皿中，随后 用镊子慢慢将胚取出接种至培养基表面。将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件 下培养7天，出现愈伤组织团块，愈伤组织诱导率见表1。
[0039] 步骤五：胚性愈伤组织的诱导
[0040] 外植体在愈伤诱导培养基上培养20天后，部分幼胚顶端膨大并长出金黄色的愈 伤组织团块，部分幼胚顶端愈伤组织为褐色水渍状并逐渐萎蔫；用解剖刀将幼胚顶端金 黄色愈伤组织团块切下，转接到最佳的愈伤诱导培养基（含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、 0. 2mg/L KT和2. 0mg/L 2, 4-D的MS培养基）上，在25摄氏度、黑暗条件下继续培养。
[0041] 表1不同诱导培养基对黄菖蒲愈伤组织诱导的影响
[0042]
[0043] 注：所取果实为花后50天，采用SPSS 20.0计算均值、标准误并进行差异显著性分 析，分析方法为Duncan新复极差法，检测水平为P < 0. 05。
[0044] 由表1试验结果，经差异显著性分析可知：不同处理间差异不显著，结合愈伤诱导 率和愈伤生长势，确定含0. 2mg/L KT和2. Omg/L 2, 4-D的MS培养基为愈伤诱导最佳培养， 诱导产生的愈伤组织颜色金黄、颗粒性明显，愈伤团块较大。进而确定了步骤（5)中的最佳 的愈伤诱导培养基。
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