药代动力学动物模型的制作方法
【专利说明】药代动力学动物模型
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种使用非灵长类动物物种评估人血清白蛋白变体（包括修饰的白 蛋白，例如遗传融合物、辄合物与缔合物）的一种或多种（若干种）药代动力学特性的方 法。本发明还涉及特别适于评估人血清白蛋白变体或其修饰形式的一种或多种（若干种） 药代动力学特性的动物模型。
[0004] 发明背景
[0005] 白蛋白是一种在哺乳动物血浆中天然发现的蛋白质，它是血浆中最丰富的蛋白 质。它在维持所希望的血液渗透压方面具有重要作用，并且在血流中的各种物质的运输中 也具有重要作用。
[0006] 新生儿Fc受体（FcRn) "布拉姆贝尔（Brambell) "是一种双功能分子，有助于维 持哺乳动物（如人类）的血清中高水平的免疫球蛋白同种型G(IgG)和白蛋白。已经发现， FcRn通过一种pH依赖机制而从细胞内降解挽回白蛋白和IgG，从而延长其血清半衰期。已 经发现，野生型人血清白蛋白（HSA)的血浆半衰期大约为19天。
[0007] 很好地描述了白蛋白在药物递送中的用途。治疗活性剂可以例如辄合至白蛋 白上（W0 2000/69902)或治疗活性多肽可以遗传地融合至白蛋白上并被表达为嵌合蛋 白（W0 2001/79271和WO 2003/59934)或小的酸性或疏水性治疗活性剂可以可逆地缔合 至白蛋白上（克拉格-汉森（Kragh-Hansen)等人，2002,生物与制药公报（Biol.Pharm. Bull.) 25,695和WO 2000/71079)。通过将具有很少或没有白蛋白结合特性的药学上有 益的化合物缔合至一个具有白蛋白结合特性的部分上此类化合物也可以实现可逆地结合 至白蛋白上（库尔茨斯（Kurtzhals)等人，1997,药学杂志（J. Pharm. Sci. )86:1365,和 WO 2010/065950)。克拉茨（Kratz)，2008，J. Controlled Release(控制释放杂志）132， 171-183提供了所有这些技术的综述。使用白蛋白递送药物的益处在于治疗剂的半衰期较 长和/或控制释放治疗剂和/或靶向选择性组织或器官。
[0008] 已经描述了多种天然的白蛋白变体。小田切（Otagiri)等人，2009,生物与制药公 报（Biol. Pharm. Bull.) 32 (4)，527-534披露了 77种已知的白蛋白变体，22种发现于结构域 I中，30种发现于结构域II中并且25种发现于结构域III中。已经鉴定了多种其他天然变 体并且已经分析了这些变体中的一些的FcRn结合（安德森（Andersen)等人（2010)，临床 生物化学（Clinical Biochemistry) 43, 367-372 ;加利安奴（Galliano)等人（1993)生物化 学与生物物理学学报（Biochim. Biophys. Acta) 1225, 27-32 ;米尼奇奥提（Minchiotti)等 人（1987)生物化学与生物物理学学报916,411-418 ;高桥（Takahashi)等人（1987)美国 国家科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84,4413-4417 ;卡尔森（Carlson)等人（1992) 美国国家科学院院刊89,8225-8229 ;(皮奇，R. J. (Peach，R. J.)和布伦南，S. 0. (Brennan， S.O.)，（1991)生物化学与生物物理学学报1097:49-54)。使用小鼠模型的天然发生 的人白蛋白变体的半衰期描述于岩生（Iwao)等人（2007)B.B.A.蛋白质与蛋白质组学 (B.B.A. Proteins and Proteomics) 1774,1582-1590 中。此外，已经在 TO 2011/051489、W0 2011/124718、WO 2012/059486、TO 2012/150319W0 2011/103076 以及 WO 2012/112188 中 描述了一系列对FcRn具有改变的结合的人工白蛋白变体，这些公开都没有披露关于白蛋 白变体在动物模型中的半衰期测量值的数据。
[0009] 在首次向人给予之前，经常在临床前研发中使用动物预测治疗剂在人类中的药代 动力学。为了协助这些预测，经常使用具有不同大小和体重的动物。种间类比法是基于以 下假设，即在动物之间存在可以通过简单的数学模型描述的解剖、生理和生化相似性。多种 动物物种已经成功地用于种间类比法中，包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、食蟹猴、狒狒、猕猴、狗、 猪以及绵羊（马哈茂德I. (Mahmood I.) (2004)新药研发（New Drug Development)，临床 药理学和生物药剂学监管范式（Regulatory Paradigms for Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics)，由占达哈斯G.沙哈瓦拉（Chandrahas G. Sahajwalla)编辑，英富曼医 疗保健出版社（Informa Healthcare)，第 137-163 页，出版 ISBN :978-0-8247-5465-5)。猪 对于小分子（哈尔 C. (Hall C.)等人（2012) J. Pharma Sci.(药学杂志）101，1221-1241) 和蛋白质（拉尔森 M. 0· (Larsen M. 0·)和罗兰 B. (Rolin B.) (2004) ILAR 杂志（ILAR 了〇1^仙1)45,303-313;郑1(21^1^￥.)等人（2012)滅匕8 4,243-255)而言是公认的模型。 的确，哥廷根迷你猪（GSttingeii minipig)由于其与人类的生理和解剖相似性在药物研 究中作为大型动物模型正变得越来越重要并且逐渐在临床前研究中取代狗和非人灵长类 (苏恩德豪夫 C. (Suenderhauf C.)和帕洛特 N. (Parrott N.) (2013)药学研究（Pharm. Res.) 30,1-15)〇
[0010] 当前可供用于对改进的FcRn结合HSA变体将具有延长的半衰期的概念验证进行 测试的仅有的非灵长类动物模型是人FcRn转基因小鼠（纯合地敲除（KO)小鼠基因并且杂 合地敲入（KI)人类基因）（罗佩尼安（Roopenian)等人（2003)免疫学杂志（J. Immunol.) 第170卷，第3528-3533页）。然而，从测量HSA的半衰期的观点来看此模型具有重要的 局限，因为小鼠含有高循环浓度的、以比野生型HSA大6倍的亲和力结合人FcRn的小鼠 血清白蛋白（安德森J.T. (Andersen J.T.) (2010)生物化学杂志（J Biol.Chem.) 12; 285(7):4826-36)。
[0011] 附图简要说明
[0012] 图1示出了白蛋白变体与ShFcRn的结合。在pH 6. 0下，注射每种白蛋白变体的连 续稀释物（1〇 μΜ-〇· 3 μΜ)覆盖固定的 shFcRn。（A)HSA Wt，（B)HSA K573P，（C)HSA K573F， (D)HSA K573W，（E)HSA K573H 以及（F)HSA K573Y。
[0013] 图2示出了白蛋白变体与可溶性大鼠 FcRn(srFcRn)的结合。在pH 6. 0下，注射 每种白蛋白变体的连续稀释物（1〇μΜ-〇·3μΜ)覆盖固定的srFcRn。（A)HSA Wt，（B)野生 型大鼠血清白蛋白（RSA)，（C)HSA K573P，（D)HSA K573F，（E)HSA K573W，（F)HSA K573H 以 及（G)HSA K573Y。
[0014] 图3示出了白蛋白变体与可溶性小鼠血清白蛋白（smFcRn)的结合。在pH 6. 0下，注射每种白蛋白变体的连续稀释物（10μΜ-0. 3μΜ)覆盖固定的smFcRn，Wt HSA(K)O μ Μ-3· 0 μ Μ)除外。（A)HSA Wt，（B) MSA，（C) RSA，（D)HSA K573P，（E)HSA K573F，（F) HSA K573W，（G)HSA K573H 以及（H)HSA K573Y。
[0015] 图4示出了白蛋白变体与可溶性猕猴FcRn(srmFcRn)的结合。在pH 6· 0下，注射 每种白蛋白变体的连续稀释物（ΙΟμΜ-0. 3μΜ)覆盖固定的srmFcRn。（A)野生型猕猴血 清白蛋白（rmSA)，（B)MSA，（C)RSA，（D)HSA K573P，（E)HSA K573F，（F)HSA K573W，（G)HSA K573H，（H)HSA K573Y 以及（I)HSA Wt。
[0016] 图5示出了白蛋白变体与可溶性狗FcRn(dFcRn)的结合。在pH6. 0下，注射白蛋 白变体的连续稀释物覆盖固定的可溶性狗FcRn。（A)野生型狗血清白蛋白（DSA)，（b)HSA， (C)HSA K500A，（D)HSA K573P，（E)HSA K573W，（F)HSA K573F，（G)HSA K573Y 以及（H)HSA K573H，（I)rmSA，（J)野生型猪血清白蛋白（PSA)，（K)RSA，（L)MSA。
[0017] 图6示出了白蛋白变体与可溶性猪FcRn(pFcRn)的结合。在pH 6. 0下，注射白蛋 白变体的连续稀释物覆盖固定的可溶性猪FcRn。（A)PSA，（b)HSA，（C)HSA K500A，（D)HSA K573P，（E)HSA K573W，（F)HSA K573F，（G)HSA K573Y 以及（H)HSA K573H，（I) rmSA，（J) DSA， (K) RSA，（L)MSA0
[0018] 图7示出了来自（人、猕猴、奶牛、山羊、绵羊、骆驼、猪、狗、豚鼠、兔、大鼠以及小 鼠）的FcRn HC的ClustalW比对的所选区域。在所有序列中相同的氨基酸残基由（*)表 示，保守性取代由（:）表示，并且半保守性取代由（.）表示。SEQ ID NO: 16的V52和H161 用粗体高亮。比对参数是开放和末端空位罚分10,扩展和分离空位罚分〇. 5,使用评分矩阵 Blosum0
[0019] 发明详细说明
[0020] 本发明提供了一种用于评估与野生型HSA相比的变体人血清清蛋白（HSA)的一种 或多种（若干种）药代动力学特性的方法。野生型HSA和变体HSA通过与配偶体（如治疗 剂、疫苗或诊断剂）融合、辄合或缔合而被修饰的分子的药代动力学特性是特别令人感兴 趣的。
[0021] 本发明的一个优点在于它通过提供一种非灵长类动物模型而减少用于筛选包含 白蛋白的药物时对灵长类动物模型的需要，该非灵长类动物模型可以产生一种或多种（若 干种）药代动力学特性的曲线，这些曲线可以被合理地外推以指示人类药代动力学曲线看 起来有可能像什么。
[0022] 在本发明的方法中使用的动物模型的特征在于野生型HSA对所述动物的天然 FcRn的结合亲和力与所述动物的天然白蛋白的结合亲和力相同或比所述动物的天然白蛋 白的结合亲和力高。
[0023] 定义
[0024] 术语"结合亲和力"通常是指分子（例如，IgG或白蛋白）的单个结合位点与其结 合配偶体（例如，抗原或FcRn)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如在 此使用的，"结合亲和力"是指反映在结合对的成员（例如，白蛋白和FcRn)之间的1:1相互 作用的固有结合亲和力。分子（X)对其配偶体（Y)的亲和力通常可以由平衡解离常数（Kd) 表示，计算为比率iw/Mk/kJ。可以通过本领域已知的方法测量结合亲和力。一种优 选方法是表面等离子体共振（SPR)，例如使用一种如在此示例的Biac〇re(GE医疗公司（GE Healthcare))仪器。内源FcRn对和白蛋白（例如HSA与hFcRn，狗白蛋白与狗FcRn等） 的结合亲和力的范围通常是从〇. 2至3. 2微摩尔。
[0025] 相对于白蛋白，术语"修饰的（modified) "或"修饰（modification) "意指通过添 加或删除与白蛋白的氨基酸序列不相关的分子（例如除去脂肪酸或添加配偶体分子）而改 变白蛋白。特别是可以通过辄合、融合或缔合配偶体而修饰白蛋白。将对白蛋白的氨基酸 序列（例如SEQ ID NO:2)的改变称作变体并且不被认为是修饰。
[0026] 相对于白蛋白，术语"辄合的（conjugated) "、"辄合物（conjugate) "或"辄合 (conjugation) "是指辄合至辄合配偶体（如有益的试剂，例如治疗剂和/或诊断剂）的野 生型HSA或变体HSA或其片段。可以对白蛋白的N-末端和/或C-末端进行辄合，但是可 替代地或另外地，可以对白蛋白内的一个或多个（若干个）适合的氨基酸位置进行辄合。具 体而言，未涉及在二硫键中的半胱氨酸残基适于辄合。WO 2010/092135描述了一种具有适 于辄合的另外的半胱氨酸残基的变体白蛋白。用于将辄合配偶体辄合至白蛋白或其片段上 的技术在本领域是已知的。WO 2009/019314披露了适于将辄合配偶体（例如治疗剂）辄合 至多肽上的技术的实例，这些技术也可以应用于本发明中。此外，WO 2009/019314(通过引 用而特此结合）的第37至44页披露了可以辄合至转铁蛋白上的化合物和部分的实例并且 这些化合物和部分也可以辄合至本发明的白蛋白变体上。
[0027] 相对于白蛋白，术语"融合的（fused)"或"融合（物）（fusion)"是指遗传地融合 至融合配偶体（如有益的试剂，例如治疗多肽和/或诊断多肽）的Wt HSA或变体HSA或其 片段。一般在白蛋白的N-末端或C-末端或有时在两端进行融合。可替代地或另外地，可以 主要在白蛋白分子内进行融合，在这种情况下，优选的是将融合配偶体定位在白蛋白的结 构域之间。例如，可以将融合配偶体定位在结构域I与结构域II之间和/或结构域II与结 构域III之间。与白蛋白或其片段的融合物相关的教导在本领域是已知的并且熟练人员应 理解此类传授也可以适用于本发明。WO 2001/79271的表1、WO 2001/79258的表1(第11 页）、W0 2001/79442 的表 1 (第 11 页）、W0 2001/79443 的表 1 (第 12 页）、W0 2001/79443 的表 1 (第 11 页）、TO 2003/060071 的表 1、TO 2003/59934 的表 1、TO 2005/003296 的表 UWO 2007/021494的表1以及WO 2009/058322的表1(将所有表通过引用而特此结合）包 含可以融合至白蛋白或其片段上的融合配偶体（例如治疗多肽）的实例，并且这些实例也 适用于本发明。
[0028] 相对于白蛋白，术语"缔合的（associated) "、"缔合物（associate) "或"缔合 (association) "是指包含Wt HSA或变体HSA或其片段以及缔合配偶体（如治疗剂和/或 诊断剂）的组合物，该缔合配偶体通过非共价结合而结合或缔合至白蛋白或其片段上。这 样的一种缔合物的一个实例是白蛋白和通过疏水相互作用而缔合至白蛋白上的脂质。此类 缔合物在本领域中是已知的，并且它们可以使用熟知的技术来制备。适于与白蛋白缔合的 分子在本领域是已知的，优选地，它们是酸性的、亲脂的和/或具有电负性特征。此类分子 的实例给出于克拉格-汉森（Kragh-Hansen)等人，2002, Biol. Pharm. Bull.(生物与制药 公报）25,695(通过引用而特此结合）的表1中。此外，WO 2000/71079描述了白蛋白与紫 杉醇的缔合并且紫杉醇被包括在本发明之中。
[0029] 相对于白蛋白和FcRn，术语"天然的"是指遗传地表达于特定动物中的白蛋白或 FcRn蛋白。小鼠中的天然白蛋白一般是对应于UniProt登录号P07724的内源小鼠血清白 蛋白。FcRn包括一条FcRn重链（HC)和一种β 2微球蛋白（β 2m)。小鼠中的天然FcRn - 般是对应于UniProt登录号Q61559的内源小鼠 FcRn HC和具有UniProt登录号为Q91Z73 的小鼠 i32m。然而，天然白蛋白或FcRn可以是一个转基因，它以一种稳定方式被整合进动 物的基因组中并且其中该动物的对应基因已经被敲除。一个实例是转基因小鼠，其中已经 将人FcRn HC整合进小鼠的基因组中并且小鼠 FcRn HC已经被敲除（罗佩尼安（Roopenian) 等人（2003)免疫学杂志（J. Immunol.)第170卷，第3528-3533页）。在这样的一种动物中， 人FcRn HC将被认为是转基因动物的天然FcRn的一部分。天然FcRn还可以是一种FcRn 变体，其是天然发生的或通过人为干预而产生的变体。这样的一种变体的一个实例是具有 以下突变中的一种或多种的小鼠 FcRn(SEQ ID N0:13) :M73V和E184H。
[0030] 相对于白蛋白或FcRn，术语"野生型"（wild-type/Wt)意指具有与在动物或在人 类中天然发现的白蛋白或FcRn(该动物或人类的内源基因序列）相同的氨基酸序列的白蛋 白或FcRn。应理解，野生型白蛋白或野生型FcRn没有通过人为干预而产生的遗传改变，例 如通过如在转基因动物的产生中的基因敲除/敲入而产生的遗传改变。SEQ ID N0:2是来 自智人的成熟的野生型白蛋白。更多的野生型白蛋白和野生型FcRn分子列于表1和3中。
[0031] 术语"序列一致性"描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传学 趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5· (λ 0版或更新版本）的尼德尔（Needle)程 序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman (尼德尔曼）和 Wunsch(翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸 序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：（一致的残基X 100)八比 对长度-比对中的空位总数）
[0032] 术语"治疗剂"、"治疗化合物"、"治疗分子"或"药物"可互换地使用并且是指化合 物、化合物的混合物、或生物大分子（例如肽、蛋白质、脂质、核酸（例如DNA或RNA)、病毒） 或与化合物缔合的生物大分子。治疗剂包括可以预防、改善或治愈医学病症的药剂。治疗 剂可以是纯化的、基本上纯化的或部分纯化的。根据本发明，"药剂"还包括辐射治疗剂和疫 苗。
[0033] 术语"HSA变体"或"变体HAS"意指来源于人血清白蛋白的、在一个或多个（若干 个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺失）的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置 换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据 一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。变体还可以是HSA的一个功能片段。片段可以由一 个来源于白蛋白的未中断序列组成或可以包括两个或更多个来源于白蛋白的不同部分的 序列。根据本发明的片段的大小为超过大约100个氨基酸残基，优选超过150个氨基酸残 基，更优选超过200个氨基酸残基，更优选超过300个氨基酸残基，甚至更优选超过400个 氨基酸残基并且最优选超过500个氨基酸残基。在一个优选实施例中，一个片段对应于白 蛋白结构域中的一个或多个（若干个）。本发明的优选的白蛋白结构域是由SEQ ID N0:2 的氨基酸残基1至194± 1至15个氨基酸组成的HSA结构域I ;由SEQ ID NO: 2的氨基酸残 基192至387±1至15个氨基酸组成的HSA结构域II以及由SEQ ID NO:2的氨基酸残基 381至585±1至15个氨基酸组成的HSA结构域III或这些结构域中的一个或多个（若干 个）的组合，例如融合在一起的结构域I和II、结构域II和III或结构域I和III。可以经 由人为干涉通过改变编码HSA的多核苷酸序列而获得改变的多肽（变体）。变体白蛋白与 SEQ ID NO: 2优选至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优 选至少90%，最优选至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或 至少99. 8%-致并且保持HSA的至少一种主要特性。通常，HSA的变体或片段将具有至少 10%(优选至少50%、60%、70%、80%、90%或95%)的!^配体结合（例如胆红素结合） 活性和至少50% (优选至少70%、80%、90%或95%)的HSA肿胀活性（重量对重量）。可 以通过由霍福斯，J. C. (Hoefs，J. C.) (1992)肝脏病学Ofepatology) 16:396-403描述的方 法确定白蛋白、白蛋白变体或白蛋白片段的肿胀活性（亦称胶体渗透压）。胆红素结合可通 过在527nm处相对于HSA的荧光增强来测量。将胆红素（1.0 mg)溶解于50微升的IM NaOH 中并用去矿物质水稀释至l.OmL。将胆红素原液稀释于IOOmM Tris-HCl(pH 8. 5)、lmM EDTA 中，以在焚光计比色皿中给出〇· 6nmol胆红素/mL。在HSA :胆红素比率从0至5mol :mol的 范围内，在用HSA滴定过程中，通过在448nm处激发并在527nm(IOnm狭缝宽度）处发射而 测量荧光。当与HSA相比时，变体对FcRn可以具有改变的结合。该变体多肽序列优选是一 种在自然界中未发现的多肽。
[0034] 术语"调节序列"意指为插入动物体内的多核苷酸的表达所需的所有组分（例如 核酸序列）。每个调节序列对于编码转基因多肽的多核苷酸而言可以是天然的（即，来自相 同基因）或外源的（即，来自不同基因）。此类调节序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸 化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，调节序列包括启动子以及转 录和翻译终止信号。
[0035] 术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个调节序列相对于一种多核苷酸的转 基因序列放置在一个适当位置处，这样使得该调节序列指导转基因序列的表达。
[0036] 多种融合至野生型白蛋白上的治疗蛋白已经进入临床研发。一些实例是融合至 野生型白蛋白上的干扰素-α、融合至野生型白蛋白上的GCSF、融合至野生型白蛋白上的 GLP-I以及融合至野生型白蛋白上的因子IX。当测试这些化合物在动物模型中的半衰期 时，该测试将比较单独的治疗蛋白与融合至白蛋白上的治疗蛋白，例如GLPl和GLPl-白蛋 白。在这样一种情况下，观察这些分子之间的半衰期变化应是相当容易的，仅仅归因于肾滤 过的差异而不管使用的是什么动物。
[0037] 然而，如果希望的是研究野生型白蛋白和白蛋白变体的一种或多种（若干种）药 代动力学特性的差异（其中半衰期变化将不归因于大小差异和继发的肾滤过），则重要的 是具有一种将允许鉴定此类差异的动物模型。
[0038] 白蛋白已经从包括人类、猪、小鼠、大鼠、兔以及山羊的许多种类中得以表征，并 且它们享有高度的序列和结构同源性（参见表1)。人血清白蛋白（HSA)是一种具有585 个氨基酸、分子量为67kDa的被很好表征的多肽。白蛋白的许多特征总结于彼得斯，T.， Jr. (Peters，T.，Jr.) (1996)关于白蛋白的一切：生物化学，遗传学和医学，应用（All about Albumin:Biochemistry, Genetics and Medical, Applications)第 10 页，学术出版社公司 (Academic Press, Inc·)，奥兰多（ISBN 0-