改进的内生真菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明通常涉及一种与黑麦玉米（ryecorn)(黑麦（Secale cereale))形成稳定 共生体（共生关系，symbiotic association)的禾本科植物类（内生植物，epichloae)内 生菌。
【背景技术】
[0002] 黑麦（Secale cereale)(俗称黑麦（Rye))在全球范围内生长，通常用于生产粮食 (谷物）。粮食主要用于制作面粉、面包和用于直接消费，尤其是在具有黑麦面包消费历史 的那些国家中。黑麦的营养部分可以被用作稻草，或转换成青贮饲料，用作动物饲料，包括 用于就地放牧。
[0003] 如上所述，黑麦主要为粮食而生长。因此，在培养过程中需要有效的害虫防护，以 确保生产足量的质量合格的粮食。黑麦通常被认为是秋季农作物，其中种子一般在秋季播 种。与其它谷物或田地作物的轮种可以用来减少存在于土壤中或在作物碎肩中发展的害虫 和/或真菌病害的积聚。
[0004] 黑麦的主要害虫包括但不限于：蚜虫；牧草虫；金针虫和蛴螬；长脚蝇的蛆（大 蚊属）；麦种蝇（灰地种蝇）；潜叶虫（潜蝇属）；瑞典杆蝇（黑麦杆蝇）；地鳖（甲壳虫 (Zabrus tenebrioides));鞍癭蚊（Haplodiplosis marginata);谷类叶甲虫（黑角负泥 虫，0? gallaeciana);线虫；以及括蝓。
[0005] 用于黑麦的害虫防治（害虫控制）的已知方法包括以下做法中的一些或全部：利 用抗害虫品种，优化种植时间并播种健康种子，有效的轮种，破坏，和/或掩埋或移除作物 碎片（茬）。可能需要的其它害虫防治方法包括对植物和/或种子使用各种杀虫剂。有时， 对于害虫防治可能需要同时施加两种或更多种活性物质。
[0006] 然而，由于与经常用于这些目的的化学品相关的已知问题，许多杀虫剂的使用可 能会造成问题。许多杀虫剂是有毒的，并且可能对处理的农作物的人类和动物消费者造成 危害（Casida和Quistad，1998)。特别是，有毒杀虫剂在人类和动物体内的积累可能对个体 导致严重的健康问题，尤其是在早期发展期间。例如，杀虫剂暴露已经与呼吸系统疾病、发 育癌症有关联，并显不出对智力能力的发展具有持续影响，Zejda等人，（1993)。
[0007] 可能难以在变化的环境状况方面控制杀虫剂的使用，从而导致有毒化合物的不期 望扩散，例如，由于喷雾的漂移或由于土壤淋溶作用。另外，由于许多原因，包括不适当的 做法和处理，害虫可能发展为杀虫剂抗药性的，这可能造成对作物（粮食）产量的真正威 胁。因此，对不使用所应用的杀虫剂的害虫防治措施存在需要。
[0008] 本发明的目的是提供至少一种禾本科植物类内生真菌菌株，其在与黑麦属 (Secale spp.)中的至少一个物种结合时赋予黑麦属植物至少一定程度的害虫防护，和/ 或向公众提供一种有用的选择。
[0009] 在本说明书中，在参考专利说明书、其它外部文件、或其它来源的信息的情况下， 这通常是为了给讨论本发明的特征提供背景的目的。除非另有具体说明，否则参考这样的 外部文件不应被解释为承认这些文件或这些信息的来源在任何权限内是现有技术或构成 本领域中公知常识的一部分。
【发明内容】
[0010] 在第一方面，本发明涉及选自由以下组成的组中的禾本科植物类（印ichloae) 内生真菌（真菌内生菌，fungal endophyte)的分离菌株：AR3039 (NRRL#50716)、 AR3046 (NRRL#50576)、AR3049 (NRRL#50577)、AR3050 (NRRL#50578)、AR3064 (NRRL#50718)、 AR3067 (NRRL#50719)、AR3068 (NRRL#50720)、AR3073 (NRRL#50721)、AR3074 (NRRL#50722)、 AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它们的组合。优选地，本发明涉及菌 株 AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074 和 AR3078,优选地 AR3046、AR3050 或 AR3068〇
[0011] 在一个实施方式中，分离的菌株在生物学上是纯的。
[0012] 在第二方面，本发明涉及一种感染了内生真菌（真菌内生菌）的黑麦属植物 (Secale spp. plant)，其中，黑麦属不是内生菌的天然宿主，并且其中，植物和内生菌形成 允许植物经历正常的生命周期的稳定共生体（symbiotic association)。
[0013] 在一个实施方式中，内生菌通过垂直传播（vertical transmission)从第一代黑 麦属传播给第二代黑麦属。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直传播通过 种子进行。
[0014] 在一个实施方式中，内生菌是一种从披碱草属（Elymus spp.)中分离的内生 菌。优选地，内生菌从批木芙蓉（Elymus mutabilis)中分离。优选地，内生菌是一种禾 本科植物类内生菌（epichloae endophyte)。优选地，禾本科植物类内生菌是选自由以 下组成的组中的禾本科植物类内生菌菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、 AR3049 (NRRL#50577)、AR3050 (NRRL#50578)、AR3064 (NRRL#50718)、AR3067 (NRRL#50719)、 AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和 AR3078(NRRL#50724)，或者它们的组合。优选地，本发明涉及内生菌菌株AR3039、AR3046、 AR3050、AR3067、AR3068、AR3074 和 AR3078，优选地 AR3046、AR3050 或 AR3068。
[0015] 在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属没有显示出内生菌感染的外部症 状。
[0016] 在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属显示出正常的形态表型。
[0017] 在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属产生黑麦草碱生物碱和/或波胺。
[0018] 在一个实施方式中，与未感染内生真菌的黑麦属相比，感染了内生真菌的黑麦属 具有对一种或多种害虫增加的抗性、或对植物病害增加的抗性、或者两者。
[0019] 在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属具有对一种或多种害虫增加的抗 性，其中，一种或多种害虫选自由以下组成的组：⑴以谷溢管姐（Rhopalosiphum padi)、 麦二叉姐（Schizaphis graminum)、玉米姐（Rhopalosiphum maidis)、麦无网长管虫牙 (Metopoliphium dirhodum)、麦属(Sitobion spp.)、麦长管虫牙（Sitobion avenae)、莓 虫牙（草莓豁网姐，Sitobion fragariae)、麦双尾姐（俄罗斯小麦姐虫，Diuraphis noxis) 为代表的姐虫（姐科）物种；⑵以黑麦杆绳（Oscinella frit)、麦杆绳（Oscinella pusilla)、黑森癭蚊（Mayetiola destructor)、角潜绳属（Cerodontha spp.)、角潜绳芦_ (Cerodontha australis)、角潜绳赌螂（Cerodontha angustipennis)、潜绳虽蜂（Formia fumigata)、苹果麦杆绳（Meromyze americana)、金边龙蛇兰鞍癭蚊（Haplodiplosis marginata)、稻秆潜绳（Chlorops pumilionis)、大蚊属（Tipula spp.)、豌豆侧绳（豌豆 潜叶绳，Chromatomyia fuscula)、麦莖蜂（Cephus pygmaeus)、碗豆侧绳（Chromatomyia fuscula)、麦黄吸楽虫（Contarinia tritici)为代表的草和谷物苍绳（潜绳科；花绳 科、黄潜绳科、莖蜂科和癭蚊科）的物种；⑶以谷泥蓟马（Limothrips cerealium)、齿 角刺鬃蓟马（Limothrips denticornis)、芒缺翅蓟马（Aptinothrips rufus)、禾生枝 孢稻蓟马（Stenothrips graminum)为代表的牧草虫（蓟马科）物种；（4)以东亚飞虫皇 (Locusta migratoria)、澳洲虫皇（Phaulacridium marginale)、卵翅虫皇（Phaulacridium. Vittatum)、蚱M属（Melanoplus spp.)、眉纹麟蟀（澳洲黑麟蟀，Teleogryllus commodus) 为代表的蚱蜢和蟋蟀（蝗科和蟋蟀科）物种"5)以麦小长蝽（Nyssius huttoni)、麦 长椿（Blissus leucopertus leucopertus)为代表的虫子（长椿科）物种；（6)以尖 隐味象属（Sphenophorus spp.)为代表的象虫（象鼻虫）（象甲科）物种；（7)以美洲 粘虫（Pseudaletia unipuncta)、斜纹夜蛾属（Spodoptera spp.)、东方粘虫（Mythimna separata);南方粘虫（Persectania aversa);翦老虎（Agrostis ipsilon)为代表的粘 虫和糖蛾（夜蛾科）物种；（8)以黑角负泥虫（Oulema melanopus)为代表的叶甲（叶甲 科）物种；（9)以日本金龟子（Popillia japonica)、草地赂螬（Costelytra zealandica)、 庭园丽金龟属（Phyllopertha spp.)、欧洲切根鲍金龟（Rhizotrogus majalis)、锚纹麦穗 金龟甲（Anisoplia segetum)为代表的赂螬（white grub)(金龟子科（Scarabaeidae)) 物种；（10)以球棉粉蚁（Phenacoccus hordei)、早熟禾粉蚁（Balanococcus poae)、 Ripersella rumicis、小麦胭硕蚁（Porphyrophora tritici)为代表的粉蚁（mealybug) (粉蚁科（Pseudococcidae)和介壳虫科（Coccidae)物种；（11)以宽胸叩头虫属 (Conoderus spp.)、金针虫属（Limonius spp.)为代表的金针虫（wireworms)(叩甲科 (Elateridae))物种；（I2)以玉米距步甲（Zabrus tenebrioides)为代表的甲虫（beetles) (步甲科（Carabidae))物种；（13)以麦圆蜘蛛属（Penthaleus spp.)、红腿土螨（红足 地螨，Halotydeus destructor)、癭螨属（Aceria spp.)为代表的螨类（mites)(癭螨科 和叶爪螨科）物种；（14)以米象（Sitophilus oryzae)、谷象（Sitophilus granarius)、 麦蛾（Sitotroga cerealella)、谷蠢（Rhyzopertha dominica)、扁谷盗属（Cryptolestes spp.)、据谷盗（Oryzaephilus surinamensis)、粉斑螟蛾（Cadra cautella)、印度谷 螟（Plodia interpunctella)、杂拟谷盗（Tribolium confusum)、赤拟谷盗（Tribolium castaneum)、烟草甲（Lasioderma erricorne)为代表的藏物害虫（stored product pests)(象甲科（Curculionidae)、据谷盗科（Silvanidae)、螟蛾科（Pyralidae)、麦蛾科 (Gelechiidae)、拟步甲科（Tenebrionidae)、长蠢科（Bostrichidae))物种；（15)以长沬 虫单（Philaenus spumarius)为代表的沬4单（froghopper)(沬4单总科）物种；（16)以根腐 线虫（root lesion nematode)(根腐线虫属（Pratylenchus spp.)，特别是索恩根腐线虫 (P. thornei)、刻痕短体线虫（P. crenatus)、落选短体线虫（P. neglectus)和穿刺短体线 虫（P. penetrans))、禾谷孢囊线虫（cereal cyst nematode)(异皮线虫属（胞囊线虫属， Heterodera spp.)和斑皮线虫属（Punctodera spp.)，特别是小麦孢囊线虫（H.avenae)、 麦类胞囊线虫（地中海胞囊线虫，H. latipons)、大麦孢囊线虫（H. hordecalis)、菲利普孢 囊线虫（H.filipjevi)、稀少孢囊线虫（H.mani)、双膜孔孢囊线虫（H. bifenestra)、巴基 斯坦孢囊线虫（H.pakistanensis)和刻点斑皮线虫（P. punctata))、根结线虫（root knot nematode)(根结线虫属（Meloidogyne spp.)，尤其是奇特伍德根结线虫（M.chitwoodi)、 纳西根结线虫（禾谷类根结线虫，M. naasi)、甘蓝根结线虫（M. artiellia)、小头根结线 虫（M. microtyla)、奥特森尼根结线虫（M. ottersoni)、禾谷根结线虫（禾草根结线虫， M. graminicola)、禾本科根结线虫（M. graminis)、菊野根结线虫（M. kikuyensis)和大米草 根结线虫（M.spartinae))，莖线虫病（stem nematode)(莖线虫属（Ditylenchus spp.)， 特别是 D. dipsicai 和 D. radicicola);小麦粒线虫（seed gall nematode)(小麦粒癭线 虫（Anguina tritici))为代表的线虫物种；（16)赔蝓（slugs)(网纹野赔蝓（Deroceras reticulatum)和赔蝓属（Arion spp.)，特别是花园赔蝓（A. hortensis agg.)和微纺锤形 蛞蝓（A. subfuscus))物种。在一个实施方式中，害虫是线虫，优选是根腐线虫（短体线虫 属（Pratylenchusspp.))，或潜叶绳，角潜绳（Cerodontha australis)(双翅目：潜绳科）， 也被称为麦鞘角潜蝇。
[0020] 在一个实施方式中，感染了内生真菌的黑麦属具有对植物疾病增加的抗性，其 中植物疾病由选自由以下组成的组中的植物病原体引起：大麦黄矮病毒（Leteovirus)、 小麦土传花叶病毒（真菌传杆状病毒（Furovirus))和小麦线条花叶病毒（小麦花叶 病毒属（Tritimovirus))，野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)、草坪炭疽菌（禾生炭疽菌，Colletotrichum graminicola)、苹 果炭疽菌（Glomerella graminicola)[有性型]、链格孢属（Alternaria spp.)、草本枝 抱（Cladosporium herbarum)、塔森球腔菌（Mycosphaerella tassiana)[有性型]、附球 菌属（Epicoccum spp.)、掷抱酵母属（Sporobolomyces spp.)、匍柄霉属（Stemphylium spp.)、麦根腐平脐懦孢（Bipolaris sorokiniana)、禾旋孢腔菌（Cochliobolus sativus) [有性型]、镰刀菌属（Fusarium spp.)、小麦网腥黑穗病菌（Tilletia caries)、小麦腥 黑穆病（Tilletia tritici)、腥蟾（Tilletia laevis)、腥黑粉菌（Tilletia foetida)、 禾谷黑膜座菌（Hymenula cerealis)、禾谷头孢霉（麦类条斑病菌，Cephalosporium gramineum)、麦根腐长懦抱（Helminthosporium sativum)、禾旋抱腔菌（Cochliobolus sativus)[有性型]、胡和鬼伞菌（Coprinus sychromorbidus)、看麦娘双极毛孢 (Dilophospora alopecuri)、小麦矮化腥黑穗病菌（Tilletia controversa)、紫瘢麦角 菌（Claviceps purpurea)、麦角蜜孢菌（Sphacelia segetum)[无性型]、大刀镰刀菌 (Fusarium culmorum)、假冰草壳抱（Pseudoseptoria donacis)、禾谷类晕斑病菌（小 麦白秆病，Selenophoma donacis)、印度尾孢黑粉菌（Neovossia indica)、小麦印度腥 黑穗病（Tilletia indica)、隐匿柄锈菌（小麦叶锈病，Puccinia recondita)、孢锈菌 (Aecidium clematidis)[无性型]、草坪褐条斑病（Cercosporidium graminis)、禾单隔 抱（Scolicotrichum graminis)、小麦叶枯病菌（Phaeosphaeria herpotrichoides)、小 球腔菌属病菌（Leptosphaeria herpotrichoides)、小麦散黑穆病（Ustilago tritici)、 微座孢属斑病（Microdochium nivale)、雪腐镰孢（Fusarium nivale)、小麦雪霉病 (Monographella nivalis)[有性型]、麦类白粉菌（Erysiphe graminis)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、强雄腐霉（Pythium arrhenomanes)、德巴利腐霉（Pythium debaryanum)、禾生腐霉（Pythium graminicola)、终极腐霉（Pythium ultimum)、玉蜀 黍赤霉（Gibberella zeae)、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)[无性型]、黑麦壳 针抱（Septoria secalis)、小麦壳针抱（Septoria tritici)、叶枯菌（Mycosphaerella graminicola)[有性型]、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis)、立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)、玉蜀泰丝核菌（Rhizoctonia zeae)、白粉菌属（Blumeria spp.)、 小麦纹枯病（Ceratobasidium cereale)[有性型]、雪腐大粒菌核病（Myriosclerotinia borealis)、白霉病菌（Sclerotinia borealis)、小麦雪腐病（Typhula idahoensis)、雪霉 病（Typhula incarnate)、雪腐病核瑚菌（Typhula ishikariensis)、雪腐病核瑚菌变种黄 花（Typhula ishikariensis var. canadensis)、颖枯壳针抱（Stagonospora nodorum)、狗 牙根壳针孢（Septoria nodorum)、菜豆褐斑病菌（Phaeosphaeria nodorum)[有性型]、 颖枯小球腔菌（Leptosphaeria nodorum)、隐条黑粉菌（Urocystis occulta)、杆锈菌 (Puccinia graminis)、黄曲霉属（Aspergillus spp.)、球黑抱霉属（Nigrospora spp.)、青 霉属（Penicillium spp.)、根霉属（Rhizopus spp.)、小麦基腐病菌（Pseudocercosporella herpotrichoides)、塔普斯梭状芽胞杆菌（Tapesia acuformis)[有性型]、条锈病 (Uredo glumarum)[无性型]、小麦黄斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis)、小麦 德氏霉（Drechslera tritici-repentis)[无性型]、壳针抱叶枯病（Helminthosporium tritici-repentis)、小麦叶锈菌（Puccinia triticina)、腐霉属（Pythium spp.)、大麦云 纹病菌（Rhynchosporium secalis)、小麦条锈病（Puccinia striiformis)、小麦全蚀病菌 (Gaeumannomyces graminis)和小麦冠腐病菌（Fusarium pseudograminearum) 〇
[0021] 优选地，植物病原体是隐匿柄锈菌（Puccinia recondita)、小麦叶锈菌（Puccinia triticina)、杆锈菌（Puccinia graminis)、镜刀菌属（Fusarium spp.)、腐霉属（Pythium spp.)、大麦云纹病菌（Rhynchosporium secalis)、小麦条锈病（条锈菌，Puccinia striiformis)、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis)、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)或小麦冠腐病菌（假禾谷镰刀菌，Fusarium pseudograminearum) 在一个实施方 式中，感染了内生真菌的黑麦属选自由以下组成的组：黑麦（普通黑麦，Secale cereale)、 山黑麦（Secale montanum)、山地黑麦（Secale strictum)、森林黑麦（Secale sylvestre) 和瓦维洛夫黑麦（Secale vavilovii)。优选地，黑麦属是黑麦（普通黑麦）
[0022] 在第三方面，本发明涉及一种制备稳定的宿主植物/禾本科植物类内生真菌组合 的方法，包括使用与接种植物形成稳定组合的至少一种内生真菌来人工地感染黑麦属植 物，其中所述宿主植物没有显示出内生菌感染的外部症状。
[0023] 在一个实施方式中，稳定的植物/真菌组合是足够稳定的以允许内生菌的垂直传 播（vertical transmission) ?在一个实施方式中，垂直传播通过分蘖（tiller)进行，特别 是通过花的分蘖进入种子，或者通过繁殖进行。优选地，从第一代宿主植物到第二代宿主植 物的垂直传播通过种子进行。
[0024] 在一个实施方式中，内生菌的垂直传播导致内生菌从第一代到第二代