降低植物中根结线虫侵害的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年10月24日、申请号为201180051656. 0、发明名称为"色 杆菌生物活性成份与代谢物"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明公开了用于防治有害生物的源自色杆菌属（Chromobacterium)的生物活 性成分和代谢物，特别是Chromobacteriumsubstugae培养物，以及它们用于防治有害生物 (pest)的方法。
【背景技术】
[0003] 天然产物是由微生物、植物和其它生物产生的物质。微生物天然产物提供了丰富 的化学多样性来源，并且将天然产物用于医药目的已有悠久的历史。虽然着重于用于人类 治疗的天然产物（其中50%以上来自天然产物），但仅有11 %的农药来自天然来源。然 而，天然产物农药可能在传统农场和有机农场中发挥防治有害生物的重要作用。微生物 (细菌、放线菌和真菌）产生的次生代谢物提供新化合物，其可单独使用或与已知化合物联 合使用，以有效防治昆虫类有害生物并减少产生耐药性的风险。有许多公知的成功用作农 业杀虫剂的微生物天然产物的实例（Thompson等人，2000 ;Arena等人，1995 ;Krieg等人 1983)〇
[0004] 微生物农药的开发始于纯培养物中微生物的分离。然后，使用体外试验、体内试验 或在温室或田野中的中试规模试验有效进行波谱筛选。同时，对微生物产生的活性化合物 进行分离和鉴定。对于微生物农药的商品化，需通过在工业规模下发酵以经济地生产微生 物，并与生物相容且批准的添加剂配制以提高药效并将在田野条件下的施用容易性和储存 稳定性增至最大。
[0005] 随着农民期待扩大他们的杀虫剂范围并随着在市场上出现新的微生物产品， 在新旧杀虫剂间存在各种相互作用的可能性。目前经常使用2种或更多种杀虫剂的组 合，将其同时或按序施加到单一作物上。为解决这些问题，科学家已使用外用和饲喂 的方法来检验油类农药、真菌农药和化学农药对有害生物和益虫的相互作用（例如参见 Chalvet-Monfray，Sabatier等人；Meunier，Carubel等人 1999;Hummelbrunner和Isman 2001 ;Wirth，Jiannino等人 2004 ;Farenhorst，Knols等人 2010 ;Shapiro_Ilan，Cottrell 等人2011等）。但目前尚未对所有的相互作用进行研究。
[0006] 色杆菌属
[0007] 0 -色杆菌菌株（即Chromobacteriumsubstugae)对许多昆虫表现出杀虫活 性（Martin，Blackburn等人 2004;Martin2004 ;Martin，Gundersen-Rindal等人 2007 ; Martin，Hirose等人2007 ;Martin，Shropshire等人2007)。作用模式表现为拒食素 和毒素活性的结合，在亚致死剂量下观察到饲喂抑制（feedinginhibition) (Martin， Gundersen-Rindal等人 2007)。具体而言，已发现Chromobacteriumsubstugae有效防 治科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsedecemlineata)成虫、西部玉米根虫（Diabrotica virgifera)成虫、南方玉米根虫（Diabroticaundecimpunctata)成虫和幼虫、小蜂房甲 虫（Aethinatumida)幼虫、小菜蛾（Plutellaxyllostella)幼虫、甘薯粉虱（Bernisia tabaci)成虫和幼虫以及南绿椿象（Nezaraviridula)成虫。
[0008] 自Martin及其同事发现Chromobacteriumsubstugae以来，至少已分离和表征 出三个色杆菌的新物种；Young等人（2008)自台湾泉水样本中分离出一个新的色杆菌物种 (C.aquaticum)，而Kampfer等人（2009)也自马来西亚收集的环境样本中分离出二个物种 (C.piscinae和C.pseudoviolaceum)〇
[0009] 色杆菌属的次生代谢物
[0010] 在所有已知的色杆菌物种中，对于紫色色杆菌（C.violaceum)有最多的研 究，关于色杆菌产生的次生代谢物的公布信息仅基于对紫色色杆菌的研究。Dimin和 Menck(2001)已就紫色色杆菌（来自土壤和水中的革兰阴性腐生生物）的药理和工业前 景发表了综述。此物种通常被认为对人类无致病性，但作为机会致病菌，其偶而在人类和 动物中成为败血症和致命感染的病原体。已知紫色色杆菌产生一种紫色色素（紫色杆菌 素），其是通过在氧的存在下使2个L-色氨酸分子稠和而生成（Hoshino等人，1987;Ryan 和Drennan;2009)。紫色杆菌素的生物合成受到群体感应（quorum-sensing)的调节，所 述群体感应是一种在革兰氏阴性菌中调节各种其它次级代谢途径的常见机制（McClean等 人，1997)。
[0011] 由Durdn和Menck(2001)总结的紫色色杆菌的其它已知代谢物包括氢氰酸、 (高）铁氧胺E(ferrioxamineB)、B_ 丙氨酸糖肽（B-lactamicglycopeptides)SQ28， 504 和SQ28, 546、抗生素（如aerocyanidin、aerocavin、3,6_ 二羟基 _1，2_ 苯异唑（3， 6-dihydroxy-l，2_indoxazene)和单酰胺菌素SB-26. 180)和抗肿瘤缩酸酸肽FR901228。依 据Durdn和Menck(2001)的综述文章，紫色色杆菌也产生不寻常的糖化合物，如胞外多糖和 脂多糖。
[0012] 线虫和杀线虫剂
[0013] 线虫是不分节两侧对称的蠕虫状无脊椎动物，其具有体腔和完整的消化系统，但 无呼吸和循环系统。其体壁由多层的角质层、具有四条纵线的皮下组织和内部肌肉组织组 成（Chitwood，2003)。其身体大部份为消化和生殖系统。大部分的线虫可自由生活，但有少 数物种是动物或植物的遍在寄生虫。
[0014] 根结线虫（Meloidogynespp.)寄生于许多的一年生和多年生作物中，同时影响市 场收率的产量和品质。该属的线虫被认为是最具经济重要性的植物寄生线虫（Whitehead， 1998)。植物寄生线虫每年造成的作物损失估计超过1000亿美元（Koenning等人1999)，超 过一半是根结线虫属造成的。该品系的接种物来自虫卵，其在有利条件下孵化以释出感染 性第二阶段幼虫（J2S)，所述幼虫在土壤中迀移到宿主植物的根上。藉由根尖渗透而发生感 染，然后幼虫移至维管组织（线虫在该处常驻），直接自植物细胞中得到养分。植物因而产 生形成虫癭（根节）的巨细胞。在整个生殖阶段（reproductivelife)中，雌虫保持埋入 植物组织中，只有虫卵自根中伸出。
[0015] 防治根结线虫最有效的方法是使用抑制虫卵孵化、幼虫活动和/或植物感染性的 杀线虫剂。因为以下环境和生理上的原因，开发化学防治植物寄生线虫的农药是具有挑战 性的工作：1.大部份植物寄生性线虫生活在靠近根部的土壤的狭窄区域中，从而难以递送 化学杀线虫剂。2.线虫的外表面是不良生化靶，无法渗透到许多有机分子中（Chitwood， 2003)。此外，口服递送有毒化合物是几乎不可能的，因为大多数植物寄生线虫物种在其侵 入和感染植物根系后才摄取宿主养分。因此，杀线虫剂往往是具有高挥发性或具有促进它 们在土壤中的流动性的其它化学和物理性质的广谱毒素。
[0016] 在过去十年中，卤代烃（如二溴乙烯、溴甲烷）是世界各地使用最频繁的杀线虫 剂。因为它们具有人体高毒性且对平流臭氧层具有有害作用，因而在蒙特利尔公约中已禁 止使用这些化合物，但因为缺乏替代品，所以仍可使用溴甲烷用于防治线虫和植物病原体。 随着有机磷的使用，氨基甲酸酯是最有效的非熏蒸类杀线虫剂。可惜的是，大部分氨基甲酸 酯如涕灭威和杀线威等也属剧毒物。2010年8月，涕灭威的制造商拜耳公司已同意取消在 美国马铃薯和柑橘中的所有产品注册，而在2018年8月底时，涕灭威将彻底淘汰。近日，阿 维菌素（由阿维链霉菌（Streptomycesavermitilis)产生的两种除虫菌素的混合物）已 注册用于杀线虫用途（Faske和Starr，2006)。Syngenta公司将该活性成分以Avictal:商标 名投放到市场中，作为棉花和蔬菜的种子处理剂。
[0017] 据报导有些微生物植物/线虫病原体对植物寄生线虫具有活性（Guerena2006)。 这些生物防治剂包括以下细菌：苏云金芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia)、穿刺巴氏菌（Pasteuriapenetrans)和P.usgae。PasteuriaBiosciences已 开始在美国南部使用P.usgae来防治草地线虫（stingnematodes)。杀线虫真菌包括木 霉菌(Trichodermaharzianum)、线虫寄生菌(Hirsutellarhossiliensis)、食线虫真 菌（H.minnesotensis)、厚垣轮枝抱菌（Verticilliumchlamydosporium)、线虫捕捉菌 (Arthrobotrysdactyloides)和淡紫拟青霉（Paecilomyceslilanicus) (Prophyta公司的 产品名称为BioAct?和.瓶e.lGOn?)。另一种真菌疏孢漆斑菌（Myrotheciumverrucaria) 可用于商业制剂（ValentBiosciences公司的DiTera"产品）。这是杀线虫真菌，由于杀线 虫化合物而具有活性。其它市售的生物杀线虫剂包括;Deny?和；BiueGircW? (B. c^acia)、 Activate^1(Bacilluschitinosporus) (Quarles，2005)和以色列的产品BioNem? (Bacillusfirmus)(目前由拜耳公司以种子处理剂V〇tiv〇K销售）（Terefe等人2009)。 据假定，微生物分离物对线虫虫卵孵化、幼虫活动和感染性的有害作用可归因于这些生 物体产生的毒素（Hallman和Sikora，1996;Marrone等人，1998;Siddiqui和Mahmood， 1999;Saxena等人，2000;Meyer和Roberts，2002)寄生或甚至扑杀线虫（Siddiqui和 Mahmood，1996 ;Kerry，2001 ;Jaffee和Muldoon，1995)、引发系统抵抗作用（Hasky-Gunther 等人1998)、改变线虫行为（Sikora和HofTman-Hergarte;r，1993)或干扰植物识别功能 (Oostendorp和Sikora，1990)的能力。
[0018] 植物杀线虫剂如植物提取物和精油可用于防治线虫（Kokalis-Burre11e和 Rodriguez-Kabana，2006)。Chitwood在其最近的综述文章中总结了利用源自植物的 化合物防治线虫的选择（Chitwood，2002)。Siddiqui和Alam(2001)证明，用印楝树 (Azadirachtaindica)和苦楝树（Meliaazadirah)的植物部分改造的盆栽土壤抑制番 茄的根结线虫产生。但目前在美国没有印楝产品注册用于防治线虫。基于含皂苷的皂树 (Quillajasaponaria)提取物（在C-3处被三糖取代并在C-28处被寡糖取代的皂树酸 的bidesmosidic衍生物）的来自智利的新植物产品(NEMA-QK)最近已经美国环保署 注册为有机杀线虫剂，并由有机物质检查委员会（OMRI)登录用于有机农业。经Monterey AgResources市售。
[0019] 通常对非宿主作物的轮作本身足以防止线虫种群达到经济损害水平（Guerena 2006)。信息素（allelochemicals)是影响植物环境中的生物行为的由植物产生的化合物。 杀线虫信息素包括polythienyls、硫配糖体（glucisonolates)、生物碱、脂质、砲类、甾体、 三砲类和酸类化合物（5^〇1^118-13111^6116和1?〇(11'181162-1(&匕&仙，2006;〇1；^￥〇〇(1，2002)。当 成长为覆盖作物时，来自化感植物（allelopathicplant)的生物活性化合物在生长期中渗 出和/或在生物质分解过程中释出到土壤中。芸苔属作物可用于生物熏蒸，所述生物熏蒸 是基于在分解土壤掺入组织（soil-incorporatedtissue)过程中释放杀生物挥发物的有 害生物防治策略（Kirkegaard和Sarwar，1998)。但Roubtsova等人（2007)在绿花椰菜腐 败组织对南方根结线虫数量的影响的研究中指出为了适当防治，需彻底混合植物组织与完 全被线虫感染的土壤体积。
[0020] 在农业土壤中的线虫防治的未来有赖于两个因素：培育抗线虫作物和发现并开发 新的广谱低毒杀线虫剂。研究、开发和注册新的化学杀线虫剂的成本非常高（超过2亿美 元），从而限制了它们的开发。从1967-1997年中，在497种注册用作农药的新活性成份 中，只有7个注册为杀线虫剂（Aspelin和Grube，1999)。除了传统的化学方法外，也建议 使用RNA干扰（RNAi)作为防治线虫的方法。藉由RNAi的基因沉默作用最初被证明用于 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans)，而最近也被证明用于植物寄生线虫如根结线虫 (Bakhetia等人2005)。为了降低植物寄生线虫造成的显著经济损失以及降低目前注册 用于线虫防治的有毒化合物的使用，寻找用作生物杀线虫剂的新的微生物株成为重要的目 标。
[0021] 根据Sasser和Freckman(1987年）的研究，线虫对世界各地的主要作物造成的作 物损失为8%至20%。植物寄生线虫可导致相当大的作物损失，估计全球每年损失约870 亿美元（Dong和Zhang，2006)。抗线虫作物物种和化学杀线虫剂是目前线虫防治的主要 选择。诸如溴甲烷的熏蒸剂对防治土壤传播的植物病害和线虫非常有效，但因为对哺乳动 物具有高毒性、臭氧耗减效应和其它残留效应，许多国家已禁止使用溴甲烷，并经国际协商 计划将其完全撤出市场（Oka等人，2000)。化学替代品如碘甲烷、1，3-二氯丙烯和氯化苦 (cholorpicrin)对哺乳动物和环境也有安全上的问题。目前正逐渐淘汰和禁用化学非熏蒸 杀线虫剂。最近，美国环保署宣布将淘汰涕灭威。
【发明内容】
[0022] 本文提供新用途和新组合，具体提供包含色杆菌属物种的菌株，特别是 Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种（Chromobacterium substugaesp.Nov.)的菌株，甚至更特别是与美国专利7, 244, 607中所述的NRRLB-30655 具有相同特征的色杆菌新物种的菌株的组合物。
[0023] 由此，本文提供调节植物中的线虫侵害的方法，其包括向植物和/或其种子和/或 用于使所述植物生长的基质施用有效调节所述线虫侵害的量的以下物质：色杆菌属物种的 菌株（特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更 特别是与美国专利7, 244, 607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌 株）的上清液、滤液和/或提取物，和/或所述上清液、滤液和/或提取物的一种或多种代 谢物，以及任选存在的另一种杀线虫物质。
[0024] 本发明也提供对至少一种有害生物具有协同作用的农药组合，其包含作为活性成 份的以下物质：（a)色杆菌属物种的菌株（特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更 特别是色杆菌新物种的菌株，甚至