利用茎段微扦插保存茄子分离群体或远缘杂交后代的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域 本发明涉及一种保存茄子新种质和临时分离群体的方法，适应于难以或不能通过有性 繁殖保存的种质资源的保存，尤其是研究用临时分离群体或具有远缘杂种不育性或不稔性 的远缘杂交后代的保存，即茎段微扦插法，是一种无性繁殖的保存方法，属于植物生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 微扦插法保存茄子种质资源在作物遗传育种理论和实践研究中具有广阔的应用前景， 通过微扦插可快速有效地将茄子难以或不能通过有性繁殖保存的种质资源进行再生，将 其稳定的保存下来，不但可以解决由于远缘杂种不育性和不稔性而造成的种质无法保存的 难题，还使以临时分离群体为试材的科学研究进行重演成为可能。
[0003] 在茄子遗传育种研究中，人们经常使用的群体有重组自交系（RIL)，加倍单倍体 (DH)群体，F2群体三种。RIL是生物学中用于遗传分析及作图的一类群体，由F2群体的个体 多代自交产生，群体中每个株系都是纯合的。在实际研究中，我们往往采用自交6-7代的 "准"RIL群体，因此构建RIL群体需要花费相当长的时间，投入大量的人力和物力。DH群 体是单倍体经过染色体加倍形成的二倍体，每一个DH植株基因型纯合，属于永久性群体。 但是产生DH植株有赖于花培技术，茄子的花药培养非常困难，而且分化率极低。另外，花 培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，破坏DH群体的遗传结构，造成较严重的偏分 离现象，从而影响研究的准确性。匕群体是暂时的分离群体，构建这种群体需要时间较短， 在群体中包含了亲本所有的基因型，可估算基因效应以及检测不同类型的互作等，但是这 类群体一经自交或者近交，其遗传组成就会发生变化，无法长久使用，因此通过某种手段将 其保存下来意义重大。
[0004] 茄子栽培种与其它茄属物种之间的杂交由于生殖障碍而被限制，因此想要利用茄 子野生种的抗病、抗逆等优良性状十分困难。由于远缘杂种？1具有杂种不育性的特点，致 使部分远缘杂交F1代形成不了完整的或成熟的植株；常具有不稔性，即开花后很难得到受 精卵，或形成受精卵后不能长成完整健康的植株，所以获得远缘杂交F2群体变得远缘杂种 匕更加艰难。研究远缘杂种F i代高效的保存方法，可以为摸索克服远缘杂交障碍的有效方 法，从而获得远缘杂交F2群体争取时间，创造机会。因此在茄子育种工作中，获得远缘杂交 后代是一件十分不易的事情，它们的保存是一项非常有意义的工作。
[0005] 茄子远缘杂交匕和F 2分离群体的保存技术在世界上鲜有报道，目前已经报道出 来的方法是 A. Frary 等（A. Frary，S. Doganlar，M. C. Daunay, et al·，2003)通 过扦插法将一个远缘杂交？2群体从美国成功运到了法国。Lorenzo Barchi等（Barchi L, Lanteri S, Portis E, et al. ,2012)为了得到更为合理准确的花青素含量，利用扦插的 方法将'305E40' X '67/3'的F2群体复制了 3次以供调查。但是扦插法存在占地面积大、 容易感染病虫害、管理过程繁琐和难以获得恒定的培养条件等缺点。还有一些人利用组织 培养法建立茄子高效的遗传体系来保存茄子种质资源，大体过程为先利用茄子上不同的组 织或器官经过脱分化得到大量愈伤组织，然后进行再分化，在愈伤组织上长出新的嫩芽，将 嫩芽接到生根培养基上进行生根培养一段时间后，定植到田间。这种方法虽然也可以保存 茄子种质资源，但是过程比较繁琐，所用时间较长，而且从愈伤组织中再分化得到的嫩芽容 易发生变异，更重要的是不同基因型对培养基成分和激素配比有着较强的选择性，从而影 响了该方法的推广应用。茄子茎段微扦插法可以解决上述问题，它可以永久保存茄子匕和 匕分离群体，步骤简单，用时短且占地面积少，没有病虫害的侵染，培养条件容易控制，便于 管理，而且由茎段发生新芽的稳定性强，不容易发生变异。因此，在遗传和育种研究中具有 十分重要的应用价值。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明旨在提供一种简单快速的保存茄子分离群体或远缘杂交后代的方法。
[0008] 本发明的基本原理是：采用合适的灭菌方法对含有叶芽的植物茎段进行灭菌处 理，在一定条件下，离体培养一段时间后，在叶腋处长出新芽，将新生嫩芽灭菌后转接到适 宜培养基上时，可获得完整的再生植株。
[0009] 本发明突出的创新点是：将研究用分离群体或不容易获得的远缘杂交种质资源保 存下来，可以进行多年研究，步骤简单，将外植体脱分化形成愈伤组织，然后进行再分化形 成嫩芽的过程简化为直接从外植体上形成嫩芽，节约了时间，而且占地面积少，没有病虫害 的侵染，培养条件易于控制，便于管理。
[0010] 保存茄子研究用分离群体或远缘杂交后代的方法(本发明的创新）： 1.茄子茎段的选取与处理：在生长健壮、无病虫害的茄子植株上采集不带花序的长 15cm左右的新生侧枝，去掉近顶部及叶柄，斜剪成含有1-2个叶片的小茎段作为小插穗，插 穗长度2-3cm，在叶腋处能隐约地看到芽点，上切口在芽上方I. 5-2cm处，下切口在芽下方 0. 5-1. Ocm处，无破裂。
[0011] 2.培养基的选择：用于微扦插（新芽分生）的培养基为MS+1. 0mg/L6-BA+0.1 mg/ LNAA，用于新芽继代的培养基为MS+0. 02mg/LNAA+l. 0mg/L6-BA，用于生根的培养基为不添 加任何激素的MS培养基。
[0012] 3.茎段初次灭菌：将冲洗干净的茄子茎段先用灭菌纸吸干表面水分，然后用70% 的酒精杀菌30秒钟，再用灭菌滤纸吸干，转至盛有0. 1%的升汞的锥形瓶中灭菌7-8分钟， 期间频繁摇晃，以达到灭菌比较充分的效果。然后将茎段取出，用无菌水冲洗4-5次，用灭 菌滤纸吸干表面水分后将形态学下端扦插于新芽分生培养基上。
[0013] 4.茎段再次灭菌：一旦发现长菌的茎段外植体，用70%酒精杀菌30s后再用0. 1% 升汞灭菌2-3min，用无菌水冲洗3-4次后吸干表面水分，转接到新的新芽分生培养基上。经 过二次灭菌后再次长菌的茎段外植体舍弃不再用。
[0014] 5.新芽初次灭菌：茎段培养7-10天后，会陆续在茎段的叶腋处长出新芽，待新芽 长到I. 0-2. Ocm左右长时将其从基部切下，注意不要切到茎段。0. 1%升汞灭菌2-3min，用 无菌水冲洗3-4次后吸干表面水分，转接到新芽继代培养基上。
[0015] 6.新芽再次灭菌：新芽培养3-4天后，部分会出现长菌情况，用70%酒精杀菌30s 后再用〇. 1%升汞灭菌2-3min，用无菌水冲洗3-4次后吸干表面水分，转接到新的继代培养 基上，继续培养。经过二次灭菌后再次长菌的新芽舍弃不再用。
[0016] 7.新芽继代与扩繁：新芽在继代培养基上培养25-30d后会长成3-4cm高的植株， 此时可进行扩繁工作，即用无菌手术刀将新段切成几个小段，每个小段至少含一个叶芽，然 后转接到继代培养基上。
[0017] 8.炼苗：新生茎段在生根培养基上培养15-20天后，会生出新根，这时打开培养瓶 瓶口，其他条件不变，进行炼苗，每天往瓶内喷洒一些无菌水保湿，培养4天。普通育苗基质 兑水至60%含水量，在121°C，0.1 Mpa条件下灭菌40min后放置至室温，然后分装到无菌的 营养钵中。将培养基中的新生小苗慢慢取出，用流动的清水洗掉根部的培养基，然后放到含 有0. 1%多菌灵+0. 1%生根壮苗剂原粉G. A-6的生根液中浸泡30秒后，定植在装满灭菌基质 的培养基中。在温度26°C，湿度90%，光周期16h的条件下培养15-20天后即可下地定植。
[0018] 本发明通过以下步骤完成： 1.茄子茎段选择与处理 在连续晴天的上午采集健康生长的茄子侧枝茎段，茎段要求为：不带花序的长15cm 左右的新生侧枝，去掉近顶部及叶柄，斜剪成含有1-2个叶片的小茎段作为小插穗，插穗 长度2-3cm，在叶腋处能隐约地看到芽点，上切口在芽上方I. 5-2cm处，下切口在芽下方 0. 5-1. Ocm处，无破裂(如图1)。
[0019] 2.茎段初次灭菌与扦插 洗去泥土和杂质，在流动的自来水下冲洗20分钟，先用灭菌滤纸吸干表面水分，然后 用70%的酒精杀菌30秒钟，再用灭菌滤纸吸干，转移至0. 1%的升汞中灭菌7-8分钟，期间 频繁摇晃，以达到灭菌比较充分的效果。然后将茎段取出，用无菌水冲洗4-5次，用灭菌纸 吸干表面水分后将形态学下端扦插于新芽分生培养基上(如图2)。
[0020] 3.茎段的再次灭菌与转接扦插 在上述条件下培养3-4天后，部分茎段会出现长菌的情况，这时尽快将其取出，切去带 菌部位，用70%酒精杀菌30s后再用0. 1%升汞灭菌2-3min，用无菌水冲洗3-4次后吸干表 面水分，转接到新的新芽分生培养基上，继续培养。及时移除已经死亡和再次长菌的茎段。
[0021] 4.新芽初次灭菌与转接 茎段培养7-10天后，会陆续在叶腋处长出新芽(如图3)，待新芽长到I. 0-2. Ocm左右长 度时(如图4)将其从基部切下，注意不要切到茎段。用0. 1%升汞灭菌2-3min，然后无菌水 冲洗3-4次后吸干表面水分，转接到新芽继代培养基上。
[0022] 5.新芽再次灭菌与转接 新芽培养3-4天后，部分会出现长菌情况，用70%酒精杀菌30s后再用0. 1%升汞灭 菌2-3min，用无菌水冲洗3-4次后吸干表面水分，转接到新的新芽继代培养基上，继续培养 (如图5)。及时移除再次长菌的新芽。
[0023] 6.生根培养 新芽培养25-30天后，可以长成3-4cm高的新生茎段(如图6)，此时可以接到新芽继代 培养基上进行扩繁，也可以转接到生根培养基上培养，促进其生根。
[0024] 7.初次炼苗 新生茎段在生根培养基上培养15-20天后，会生出新根(如图7,图8)，这时打开培养瓶 瓶口，其他条件不变，进行炼苗，每天往瓶内喷洒一些无菌水保湿，培养4天。
[0025] 8.再次炼苗基质的灭菌与分装 营养钵在75%酒精中浸泡30mi