一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞工程技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存 方法。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制 剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、 增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0003] 随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤 患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病 灶及骨髓净化都具有良好效果。
[0004] 但免疫细胞的体外培养效果很大程度上取决于病人体内的免疫细胞的多少以及 质量，但肿瘤病人体内的免疫细胞很来就较正常人要少，再加上放疗、化疗后免疫细胞的数 量就更为稀少了，因此采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化料之前进行，于是就产 生了病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间的冲突。
[0005] 如果能够提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可 解决时间冲突的问题，并且随时可以使用，对于医生选择治疗方案相当有利。
[0006] 细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损 伤的危险、为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度 操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前 最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO)，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可 使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对 细胞由毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少 对细胞的伤害。
[0007] 现有细胞冻存液的配当多采用DMSO联合动物血清，大部分为10%的DMSO与90% 的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，并且胎牛血清中 含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此不能 直接用于临床回输。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞冻存液、应用及免疫细胞 冻存方法，该细胞冻存液不含胎牛血清。
[0009] 本发明提供了一种细胞冻存液，包括：
[0010] CN 105123671 A 说明书 2/8 页
[0011] 优选的，所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。
[0012] 优选的，包括：
[0017] 优选的，包括：
[0018] CN 105123671 A 说明书 3/8 页
[0019] 本发明还提供了一种细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。
[0020] 本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，用细胞冻存液冻存免疫细胞。
[0021] 优选的，所述免疫细胞与细胞冻存液的比例为IX IO6~5X 10 7cell/ml。
[0022] 优选的，包括以下步骤：
[0023] A)免疫细胞培养；
[0024] B)将所述免疫细胞用缓冲液清洗，除去缓冲液后，与权利要求1~5任意一项所述 的细胞冻存液混合，分装，冻存。
[0025] 优选的，所述步骤A)具体为：
[0026] Al)将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，离心，吸取中间白膜层；
[0027] A2)将所述白膜层接种至含有10 %胎牛血清的RPMI1640培养基中，添加1000UI/ ml的γ干扰素，24h后添加300UI/ml的白介素2与300UI/ml的⑶3单抗，培养12~14 天，得到免疫细胞。
[0028] 本发明提供了一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法，该细胞冻存液包括：细 胞培养基〇. 7~0. 9ml/ml ;非必须氨基酸8~26mg/ml ;海藻糖0. 04~0. lml/ml ;维生素 CO. 5~10mg/ml ;人血白蛋白10~50mg/ml ;丙二醇0· 04~0· 12ml/ml ;二甲基亚讽0· 01~ 0. 07ml/ml ;香菇多糖0. 5~3mg/ml。与现有技术相比，本发明冻存液中细胞培养基可保持 渗透压、酸碱平衡和提供营养，人血白蛋白在一定程度上可以替代胎牛血清在冻存中发挥 的作用同时添加了非必须氨基酸、维生素 C和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影 响，而海藻糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不 会结晶，上述成分相互作用，从而使本发明在不含胎牛血清及DMSO含量低的情况下仍可实 现免疫细胞的冻存。
[0029] 实验表明，采用本发明细胞冻存液冻存细胞复苏后的活性可达98. 6%。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0031] 本发明提供了一种细胞冻存液，包括： CN 105123671 A m "Ti 4/8 页
[0032]
[0033] 其中，所述细胞培养基的含量优选为0. 75~0. 9ml/ml，更优选为0. 8~0. 9ml/ ml，再优选为0. 85~0. 9ml/ml ;所述细胞培养基的种类为本领域技术人员熟知的细胞培养 基即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DMEM/F12培养基。细胞培养基具有保持细胞渗 透压、酸碱平衡体系和提供营养等作用。
[0034] 所述非必须氨基酸的含量优选为10~20mg/ml，更优选为12~18mg/ml，再优选 为14~16mg/ml ;所述非必须氨基酸为本领域技术人员熟知的非必须氨基酸即可，并无特 殊的限制，本发明优选为多种非必需氨基酸组合而成，更优选为购买自GIBCO试剂的非必 须氨基酸。
[0035] 所述海藻糖的含量优选为0. 05~0. 08ml/ml ;所述海藻糖的种类为本领域技术人 员熟知的海藻糖即可，并无特殊的限制，本发明中优选为注射用海藻糖。
[0036] 所述维生素 C的含量优选为1~8mg/ml，更优选为1~5mg/ml，再优选为1~3mg/ ml 〇
[0037] 所述人血白蛋白的含量优选为15~40mg/ml，更优选为15~30mg/ml，再优选为 20 ~30mg/ml。
[0038] 所述丙二醇的含量优选为0. 06~0. lml/ml ;所述丙二醇的种类为本领域技术人 员熟知的丙二醇即可，并无特殊的限制，本发明中优选为注射用丙二醇。
[0039] 所述二甲基亚砜的含量优选为0. 02~0. 05ml/ml，更优选为0. 02~0. 03ml/ml。
[0040] 所述香燕多糖的含量优选为1~2mg/ml。
[0041] 在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培养基 0· 86ml/ml ;非必须氨基酸15mg/ml ;海藻糖0· 06ml/ml ;维生素 Clmg/ml ;人血白蛋白25mg/ ml ;丙二醇 0· 06ml/ml ;二甲基亚砜 0· 02ml/ml ;香燕多糖 lmg/ml。
[0042] 在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培养基 0. 75ml/ml ;非必须氨基酸8mg/ml ;海藻糖0. 04ml/ml ;维生素 CO. 5mg/ml ;人血白蛋白 10mg/ml ;丙二醇 0. 04ml/ml ;二甲基亚讽 0. 01ml/ml ;香燕多糖 0. 5mg/ml。
[0043] 在本发明提供的另外一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培 养基0. 9ml/ml ;非必须氨基酸26mg/ml ;海藻糖0. lml/ml ;维生素 C10mg/ml ;人血白蛋白 50mg/ml ;丙二醇 0· 12ml/ml ;二甲基亚砜 0· 07ml/ml ;香燕多糖 3mg/ml。
[0044] 本发明冻存液中细胞培养基可保持渗透压、酸碱平衡和提供营养，人血白蛋白在 一定程度上可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必须氨基酸、维生素 C和 香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而海藻糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保 护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶，上述成分相互作用，从而使本发明在不 含胎牛血清及DMSO含量低的情况下仍可实现免疫细胞的冻存。
[0045] 本发明细胞冻存液既减少了 DMSO的含量，同时又含有胎牛血清，从而保证了安全 性，可直接进行临床回输。
[0046] 本发明还提供了一种上述细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用，所述细胞冻存液 同上所述，在此不再赘述。
[0047] 本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，用上述细胞冻存液冻存免疫细胞，所 述细胞冻存液同上所述，在此不再赘述。
[0048] 按照本发明所述冻存方法优选包括以下步骤:A)免疫细胞培养；B)将所述免疫细 胞用磷酸缓冲液清洗，除去缓冲液后，与细胞冻存液混合，分装，冻存。
[0049] 其中，所述免疫细胞培养具体按照以下方法进行