红色菠菜植株的制作方法
【专利说明】红色菠菜植株
[0001] 本发明涉及红色菠菜植株（SpinaciaoleraceaL.)。本发明还涉及这种植株的种 子和子代以及得到这种植株的繁殖材料。本发明进一步涉及植株、种子和在育种程序中源 自作为种质的这种植株的繁殖材料的使用。
[0002] 菠菜（SpinaciaoleraceaL.)是作为蔬菜培育的苋科开花植物。菠菜植株的可食 用部分为营养生长期的叶。在营养生长期期间，菠菜产生环状叶。这些叶在皱叶类型的情 况下卷缩和卷曲、在半皱叶类型的情况下略卷缩、或光滑叶类型的情况下宽扁。菠菜植株的 叶通常以新鲜剪切和袋装、新鲜成束、罐装或冷冻的形式出售。主要市售的菠菜产品是新鲜 剪切和袋装菠菜。这种袋装产品或者以含有非常小、嫩的叶出售的嫩菠菜、或以含较成熟、 中型的叶出售的稍成熟波菜。嫩的和稍成熟波菜叶的尺寸均小于成熟期的成束、冷冻或罐 装菠菜的叶尺寸。通常成熟期嫩菠菜的叶不长于大约八厘米。这些嫩、甜的叶常用于沙拉， 且还可被稍微煮熟或蒸熟。
[0003] 餐馆、餐饮企业甚至超市顾客对用于沙拉或其他菜式的色彩绚丽的叶菜类蔬菜的 方式改变和需求不断上升。因此，蔬菜育种公司正在寻找带有突出色彩、更好口味和多种质 地的品种。
[0004] 虽然菠菜（SpinaciaoleraceaL.)由于其诱人的口感和高营养价值而成为受欢 迎的产品，但目前的波菜除了绿色不能向菜肴或沙拉混合添加更多颜色。最丰富多彩的菠 菜（SpinaciaoleraceaL.)迄今已知为带有红色叶柄和红色粗脉（majorvein)的绿色 叶。这些植株具有的绿色叶带有限制在叶柄和一级、二级、和在一些情况下三级叶脉所位于 的叶片区的红色叶，而在叶脉之间的叶片区是绿色的。这种植株的例子表示于图2D中。
[0005] 图1示出了菠菜叶的图片和示意性示图，指示出叶柄和椎板，其通常被指示为叶 片，带有一级、二级和三级叶脉。
[0006] 鉴于需要带有更多红色叶的菠菜（SpinaciaoleraceaL.)，本发明的目的在于提 供一种菠菜（SpinaciaoleraceaL.)植株，其具有比现有菠菜植株更多红色。
[0007] 在本发明的研究中，所形成的新型菠菜植株（SpinaciaoleraceaL.)包括导致具 有红色叶的植株的遗传决定因子，其中在至少近轴叶面（上部）叶面、优选地近轴面和远轴 面（下部）叶面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素。
[0008] 本发明的菠菜植株既诱人又美味。另外，它们比未携带本发明遗传性状的植株更 健康。本发明植株的P花青苷含量被增多，且P花青苷已被报道过具有多种健康益处。0 花青苷具有优异的抗氧化活性。而且，0花青苷已被报道过具有抗癌作用。
[0009] 因此本发明提供一种菠菜植株（SpinaciaoleraceaL.)，包括使植株具有红色叶 的遗传决定因子，其中在至少近轴叶面、优选地在近轴叶面和远轴叶面二者的叶脉之间的 至少部分菠菜叶表皮细胞包含红色素，其中所述遗传决定因子被包括在菠菜植株的代表性 种子中，种子所登记的NCHMB保藏号为NCHMB41954、NCHMB41955和NCHMB41956。
[0010] 在本文中，"菠菜"意于包括SpinaciaoleraceaL.。
[0011] 通过半显性或不完全显性遗传决定因子确定本发明的性状。在不完全显性或半显 性的情况下，杂合子的表型在亲本纯合子表型之间的中间。这种类型的遗传也可以表示为 中间遗传。遗传决定因子可存在于纯合的或杂合状态以产生本发明的表型性状。
[0012] 本发明的遗传决定因子表现为单一半显性或不完全显性基因座。该基因座可以是 基因或等位基因并且还可以包括调控元件。
[0013] 在本文中，"遗传决定因子"为潜在的基因要素，其形成本发明的表型性状。"表型 性状"是表现型的，其中植株具有红色叶，其中在至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶 面的叶脉之间的菠菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素。可互换使用"基因性状"、"性状" 和"表型性状"。
[0014] 菠菜（SpinaciaoleraceaL.)种子的代表性样品包括遗传决定因子，其存在时 导致植株具有红色叶，其中在至少近轴叶面、优选地近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠 菜叶的至少部分表皮细胞包含红色素，所述代表性样品在2012年4月6日于Aberdeen的 NCHMB以登录号NCHMB41954、NCHMB41955和NCHMB41956进行保藏。这些保藏物的种子 纯合地包含遗传决定因子。这些保藏物不符合均一性和稳定性的要求，因此它们并不构成 植物品种。
[0015] 赋予本发明表型性状的遗传决定因子可转移至所有SpinaciaoleraceaL.类型， 如半皱叶、半皱叶和光滑的菠菜类型。
[0016] 本发明植株全部或部分叶的红色为紫红色、或酒红色（burgundyred-like colour)。本领域技术人员可容易观察到本发明植株全部或部分叶的红色，还可利用RHS 比色表确定（英国皇家园艺学会，伦敦，英国）。在该比色表上，本发明的红色类似于颜色 187A、187B、187C、187D、N186B、N186C或N186D。
[0017] 在一种实施方式中，本发明涉及一种菠菜（SpinaciaoleraceaL.)植株，其包含 本发明的遗传决定因子，其中所述遗传决定因子以杂合状态存在。
[0018] 可通过图2B描述的本发明叶的红色识别杂合地携带所述遗传决定因子的本发明 植株，其任选地在植株的头两片叶已处于收获阶段时、优选地在植株的头两片叶处于完全 长成时。
[0019] 术语"可收获阶段"对于熟练的菠菜种植者来说是清楚的，且更具体地意为在菠菜 植株开始抽薹和花序梗发育之前来自嫩叶阶段通过成熟叶阶段的叶阶段。可以互换使用 "可收获阶段"、"收获阶段"和"收获期"。
[0020] 熟练的菠菜种植者知道何时到达嫩叶阶段和可收获菠菜。植株在收获时越年轻， 其叶越小和越嫩，这是顾客所喜欢的。另一方面，如果过早收获菠菜，种植者将在其田地上 获得较少公斤的产品。熟练的菠菜种植者会平衡二者以使利润最大化。虽然可更早收获和 /或以不同密度种植嫩叶菠菜，典型地以8百万种子/公顷的密度种植嫩叶菠菜，且在菠菜 植株在大约IOcm高时收获。在嫩叶阶段，菠菜植株典型地具有至少两片完全长大的叶。真 叶意味着已经形成子叶之后开始发育的叶。
[0021] 在携带杂合遗传决定因子的本发明植株中，处于收获阶段的叶至少局部是红色 的。更具体地，所述植株具有红色叶柄和叶片，叶片带有红色一级和二级叶脉和在这些叶脉 之间的叶的近轴叶面（例如上侧）的叶面积上有额外的微红色。这种植株的实例呈现在图 2B中。在本发明的所述植株中，因此红色不限于叶柄和粗脉上的叶区域。
[0022] 叶呈现携带本发明杂合遗传决定因子的微红色植株的百分比因基因背景不同而 不同，但是总是高于种植于相同环境下的未携带本发明遗传决定因子的红脉菠菜植株。
[0023] 在携带本发明杂合遗传决定因子的一些植株中，红色可被更多地限制在接近叶粗 脉的区域，而在携带本发明杂合遗传决定因子的其它植株中，红色素可呈现在几乎遍及叶 片的叶表皮细胞中。
[0024] 可通过检查近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的菠菜叶的表皮细胞是否为红色来 分析本发明的植株。可用锋利镊子和随后用透射光显微镜或者从叶近轴叶面或者从远轴面 表面剥离表皮细胞层。
[0025] 在携带杂合遗传决定因子的本发明的植株中，以优选增加的顺序，大约10-100%、 15-90 %、20-80 %、30-70 %的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴叶面的叶 脉之间的菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体（stomatalcomplex)的细胞包含红色素。更 具体地，在携带杂合遗传决定因子的本发明的植株中，大约15-80 %、更具体地20-80 %和 更具体地30-80%的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴叶面的叶脉之间的 菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体的细胞包含红色素。
[0026] 在涉及菠菜（SpinaciaoleraceaL.)植株的本发明进一步的实施例中，植株包括 纯合状态下的本发明遗传决定因子。
[0027] 可通过红叶柄和红色叶识别携带杂合遗传决定因子的本发明的植株，任选地在植 株已有头两片叶时/优选地在植株的头两片叶完全长成时，植株处于可收获阶段。
[0028] 图2A表示出携带杂合遗传决定因子的本发明的植株的实例。
[0029] 携带杂合遗传决定因子的本发明的植株具有红色的植株地上营养部分。
[0030] 此处所使用的"地上营养植株部分"意指不参与有性生殖的地上植株部分，不包括 下胚轴和子叶，包括叶、茎和叶柄。
[0031] 已发现携带杂合遗传决定因子的本发明的植株花序和花也可具有红色。
[0032] 携带纯合遗传决定因子的本发明的植株在收获阶段在植株的整个叶面具有红色。 更具体地，所述植株在收获阶段在植株的整个叶面具有均匀的红色。
[0033] 携带纯合遗传决定因子的本发明植株的红色地上营养部分、更具体地处于收获阶 段的叶的红色为紫红色、或酒红色。
[0034] 用于本申请中的红色包括被感知为紫色的颜色。
[0035] 本发明植株的地上营养部分的红色可使用RHS比色表（英国皇家园艺学会，伦敦， 英国）确定，优选地选自RHS码为187六、1878、187(：、1870、附868、附86(：和/或附860或其 组合的颜色。更具体地，用所登记的NCHMB保藏号为NCHMB 41954、NCHMB 41955和NCHMB 41956的种子种植的植株中可见这种红色。在不同的菠菜类型或品种中，颜色可以不同，但 本领域技术人员仍感知为红色。
[0036] 虽然植物育种者和种植者普遍使用RHS比色表，清楚的是，可使用其它比色表或 体系确定颜色。例如，还可使用Munsell颜色体系在RGB色码中指定或者可以用比色计来 确定颜色。本领域技术人员已知如何使用这种不同的色彩体系和在不同色彩体系之间转换 颜色。用于这些RHS颜色的RGB、CIELab和CIELCh值被列于下表中。
[0037]
[0038] 更具体地，携带纯合遗传决定因子的本发明植株的可收获的叶的至少近轴叶面、 优选地近轴叶面和远轴面具有如上所定义的颜色。
[0039] 携带纯合遗传决定因子的本发明植株的可收获叶的红色素主要定位在叶的至少 近轴叶面（如图3H所描述的）、优选地近轴叶面和远轴面（如图3G所描述的）的叶表皮 中。
[0040] 在叶表皮内，红色素被包括在表皮细胞中，不包括气孔复合体的保卫细胞。所述红 色素可存在于表皮细胞之外的其它细胞中。
[0041] 在携带纯合遗传决定因子的本发明植株中，以优选增加的顺序，大约50-100%、 60-100 %、70-100 %、80-100 %、90-100 %、95-100 %的在至少近轴叶面、优选地在近轴叶 面和远轴面之间的菠菜叶表皮细胞且不含气孔复合体的细胞包含红色素。更具体地，在 携带杂合遗传决定因子的本发明植株中，大约90-100%、更具体地95-100%和最具体地 99-100%的在至少近轴叶面的叶脉、优选地在近轴叶面和远轴面的叶脉之间的菠菜叶表皮 细胞且不合气孔复合体的细胞包含红色素。
[0042] -种实施方式中，本发明涉及菠菜（SpinaciaoleraceaL.)植株，其包含本发明 的遗传决定因子，其中在收获期的叶的P花青苷含量优选地以上升顺序值至少为55yg甜 菜苷当量/g鲜重、60yg甜菜苷当量/g鲜重、70yg甜菜苷当量/g鲜重、80yg甜菜苷当量 /g鲜重、90yg甜菜苷当量/g鲜重、100yg甜菜苷当量/g鲜重、110yg甜菜苷当量/g鲜 重、120yg甜菜苷当量/g鲜重、130yg甜菜苷当量/g鲜重、140yg甜菜苷当量/g鲜重、 150yg甜菜苷当量/g鲜重、160yg甜菜苷当量/g鲜重、170yg甜菜苷当量/g鲜重、180yg 甜菜苷当量/g鲜重、190