草莓脱毒原原种苗的获取方法及保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物工程技术领域，具体涉及草莓脱毒原原种苗的获取方法及以此方法获取的草莓脱毒种苗的保存方法。
【背景技术】
[0002]草莓是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，果实柔嫩多汁，色泽艳丽，甜酸适度，芳香浓郁，味道鲜美，营养丰富，深受人们的喜爱，故有“水果皇后”之美誉，草莓具有栽培容易、发展快和适应性广的优点，对土壤和水肥条件的要求也不高.从我国东北到海南岛、从东南沿海到新疆、西藏，全国各省都可以种植草莓，适应性很广，一般农户、果农、蔬菜生产的单位均能很快掌握，可立即转入草莓的生产。由于草莓是冬季和早春的首批上市水果，营养价值高，口味好，价格高，因此经济效益很高。含有比其他水果高10倍的维生素，而且果实中所含的鞣花酸具有抗癌效果。
[0003]近几年随着设施农业的发展，设施草莓的种植面积逐年增加。草莓种苗的繁殖主要是用匍匐茎进行无性繁殖，而多年无性繁殖造成病毒在草莓体内积累，致使草莓品质日益退化和产量越来越低。由于病毒病的为害，植株生长衰弱、结果期推迟、果实变小、畸形、叶片皱缩、生长缓慢，产量减少、果品质量明显降低，并有逐年加重趋势，经济效益大幅度下降，没有脱毒的草莓平均每667m2产值最高只能达到2000?3000元。而脱病毒草莓每667m2产值可达到6000元以上，尤其是大棚脱毒草莓，每667m2产值可达到15000?20000元，是种植一般农作物或经济作物收入的10倍。据调查草莓病毒病的危害可使草莓减产30%?80%我国因草莓病毒病每年减产35万t，直接经济损失30亿元，据调查数据显示，脱毒苗的利用率很低，还不足5%。
[0004]用茎尖培养法进行无病毒苗的培育，是目前世界上获得草莓无毒苗最普通且最有效的方法，草莓脱病毒苗，增产效果和生长优势十分明显，脱病毒苗生长快。长势旺，茎叶粗壮，开花数多，花序数、坐果率平均增加50%左右；无畸形果。果子外观好，色泽鲜红，果子大，均匀整齐。为草莓的基因转化、品种改良奠定基础，为草莓种苗脱毒和生产提供技术支持。增强种植者无毒化栽培的意识，实行无毒苗栽培是提高我国草莓产量和质量的关键措施之一O
[0005]草莓的脱毒技术和病毒检测鉴定技术操作程序繁琐，难度大，技术含量高、标准高。常规的草莓脱毒技术是直接采取田间的匍匐茎尖，其脱毒褐化率高、污染率高、成活率低，导致成本高、工作量大、耗时长。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了草莓脱毒原原种苗的获取方法及以此方法获取的草莓脱毒种苗的保存方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:草莓脱毒原原种苗的获取方法，包括以下步骤: O取材与清洗:
在8?10月份，选取田间长势健壮、结果多、果形正、具有品种典型性状的草莓匍匐茎掐取前端3?4cm，放入容量为I升的灭菌过的烧杯中，用纱布罩在杯口，常温下以自来水冲洗1.5?2小时；
2)灭菌消毒:
在超净工作台上，将步骤I)得到的冲洗过的草莓匍匐茎放入无菌烧杯中，先用75%酒精消毒30?40s，无菌水冲洗2?3遍，再用0.1%的升萊溶液消毒4?5 min，采用灭菌过的玻璃棒顺一个方向搅拌，最后以无菌水冲洗4?5遍，每次I分钟，迅速用滤纸吸干，得到无菌匍匐茎；
3)再生幼苗:
在超净工作台上用手术刀切取步骤2)得到的无菌匍匐茎的前端0.8?1cm，放入MS培养基中，培养长成幼苗；
4)茎尖脱毒及诱导:
在变倍体显微镜下，用接种针剥取幼苗上带有一个叶原基的短缩茎尖，大小为
0.2mm?0.3 mm,放入诱导培养基中诱导50?60天，长成0.5?0.8cm高的带根系的脱毒幼苗；诱导培养基为加入6-苄氨基腺嘌呤0.08?0.13mg/L和吲哚丁酸0.91?1.07mg/L的MS培养基；
5)幼苗增殖:
将步骤4)得到的脱毒幼苗放入增殖培养基中25?35天长成丛生试管苗；增殖培养基为加入6-苄氨基腺嘌呤0.19?0.21mg/L的MS培养基。
[0008]进一步的，上述的草莓脱毒原原种苗的获取方法，所述步骤3)中，再生幼苗的生长条件为:温度23?25°C，光照强度2000?30001x，光照10?14h/d，培养时间20?30d。
[0009]进一步的，上述的草莓脱毒原原种苗的获取方法，所述步骤4)中，脱毒幼苗的生长条件为:温度23?25°C，光照强度2000?30001x，光照10?12h/d，培养时间50?60d。
[0010]进一步的，上述的草莓脱毒原原种苗的获取方法，所述步骤5)中，丛生试管苗的生长条件为:温度23?25°C，光照强度2000?30001x，光照14?16h/d，培养时间25?35d。
[0011]本发明的第二个目的是提供了以上述草莓脱毒原原种苗的获取方法获取的草莓脱毒种苗的保存方法，种苗的保存培养基为加入0.5%?1.0%甘露醇的常规MS培养基，培养条件为温度5?11°C，光照强度500?8001x，光照8?10h/d，培养时间12个月；分生组织或脱毒试管苗的保存培养基为加入6-苄氨基腺嘌呤0.08?0.13mg/L、吲哚丁酸
0.91?1.07 mg/L的常规的MS培养基，制备茎尖分生组织、腋芽的茎段或培养好的试管苗，将其培养于新鲜培养基上，然后置于4°C低温黑暗条件保存。
[0012]新疆第六师农科所对现有草莓脱毒技术加以改良，采用了新的脱毒方式获得原原种苗(脱毒试管苗):是先把匍匐茎在实验室培养成组培苗，然后再用组培苗进行茎尖脱毒，大幅度降低成本，大大提高脱毒率和成活率，提高生产效率。
[0013]对于用营养繁殖的草莓，利用茎尖分生组织在遗传上比较稳定，容易再生新的植株，并且有脱毒作用的特点，在资源保存上通过处理措施达到降低和停止细胞的生命活动，使之进入休眠状态，以保持固有遗传特性的稳定和潜在活力。这种技术措施大大减少人力和物力的消耗。本发明主要是对资源合理有效保存利用，主要是对试管里的茎尖分生组织培养物、试管苗、带一个腋芽的茎段的储存，通过低温(5?11°C)储存中温度和光照条件进行调节，或在培养基中加入生长抑制剂成分，在每年更换一次新鲜培养基的条件下，可以长时间保持被储存材料的存活率。在操作上较方便，利于人工控制，比通过田间栽培植株保存品种资源要优越和经济的多。
[0014]本发明要解决的技术问题是用从试管中草莓短缩茎尖剥离一个叶原基的茎尖分生组织，获得具有根系的脱毒苗，再增殖、培养成种苗，这种方法能大幅度降低褐化率、污染率，大大提高分生组织诱导成活率和脱毒率，生根与增殖同步，缩短了组培种苗的时间。获取脱毒试管苗可以用低温(5?irC)和生长抑制剂保存资源，在每年更换一次新鲜培养基的条件下，可以长时间保持被储存材料的存活率；也可以采用茎尖分生组织、腋芽的茎段、试管苗，将它们培养于新鲜诱导培养基上，然后置于低温4°C黑暗条件，保存三年以上，仍能再生新植株。
[0015]本发明的有益效果为:本发明提供的草莓脱毒原原种苗的获取方法及以此方法获取的草莓脱毒种苗的保存方法，其创新点在于:
1、创新改良了对外植体匍匐茎尖脱毒的方式，采用了匍匐茎前端组培成试管的短缩茎尖剥离脱毒，大大降低了褐化率和污染率、尤其是内生菌的后期污染，大幅提高了茎尖分生组织的脱毒率和成活率，工作效率有效提高、成本大幅度降低；
2、获取的原原种苗(无毒试管苗)或茎尖分生组织在适宜的温度、湿度、光照条件下保存，即能保持品种的优良性状、遗传稳定性，大大减少人力和物力的消耗，给工厂化生产提供快速便捷的种苗，有效缩短从脱毒到规模生产的周期，同时有效降低了生产成本与劳动成本。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:
1、脱毒原原种苗的获取:
草莓的茎尖分生组织不带病毒。选择国内外的草莓优良品种，剥取茎尖分生组织进行离体培养，诱导出新的幼苗，称为试管苗，试管苗生根、增殖同步进行，得到的植株为种苗。
[0017]1.1采集外植体并清洗消毒；