一种生产苦杏氰甙作为杀虫剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体涉及一种生产苦杏氰甙作为杀虫剂的方法。
【背景技术】
[0002]随着我国社会经济水平的快速发展，家庭小花园、小菜园产业发展迅猛，产生了巨大的家庭用杀虫剂消费市场。家庭所用的杀虫剂不是传统的杀虫剂，是要无公害、绿色、有机的杀虫剂。
[0003]植物细胞工程是在植物组织培养基础上发展起来的新学科，具有基础理论与实验技术并举的特点，为研究从苦杏仁提取氰甙提供了理论知识。
[0004]古代很多中医书籍中均记载杏仁“有小毒”，“有毒”。苦杏仁杀虫剂被家庭中常见的蟑螂等及蔬菜害虫食后，其所含的苦杏仁甙在口腔、食道、胃和肠中遇水，经苦杏仁酶的水解后释放出氢氰酸，苦杏仁在口内嚼碎与唾液混合能产生氢氰酸，氰离子与含铁的细胞色素氧化酶结合，妨碍正常呼吸，因组织缺氧，机体陷入窒息状态；氢氰酸还能作用于呼吸中枢和血管运动中枢，使之麻痹，最后导致死亡。
[0005]氰是碳氮化合物，是蔬菜的营养元素，喷在蔬菜叶面上很快被吸收，害虫食入会中毒，48小时后，碳氮化合物分解成碳、氮营养元素被植物利用；人食用后不会对人身造成伤害。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是研制一种植物次生代谢物杀虫剂，具有杀虫活性，使用中对人畜比较安全，而且还兼有杀菌和刺激作物生长的作用，达到杀虫防病、增产增收的多重功效，主要用于家庭阳台种植的小花园、小菜园的病虫害防治。
[0008]本发明采用如下技术方案:
生产苦杏氰甙作为杀虫剂的方法，包括:选择增殖速度快而且细胞内氰甙含量高的苦杏胚芽细胞株作为种质和规模化生产苦杏氰甙两部分；其具体操作方法如下:
所述的选择增殖速度快而且细胞内氰甙含量高的苦杏胚芽细胞株作为种质步骤如下:
(1)取正季生长的苦杏胚芽，作为诱导愈伤组织的外植体，取苦杏胚芽后，注意保鲜和清洁；
(2)苦杏胚芽表面消毒:于三角瓶中放自来水60毫升自来水和2-3克洗衣粉，并将苦杏胚芽放入，在轻轻搅动1-1.5分钟；用自来水龙头小水流冲洗2-3小时后，将苦杏胚芽夹到另一个灭菌三角瓶中；倒入75%的酒精放置I分钟后，倒掉酒精；再倒入0.1%次氯酸钙12 - 15分钟后，倒出次氯酸钙，用灭菌水冲洗3次，再在无菌水中静泡3-4分钟，用灭菌过的镊子将苦杏胚芽夹到吸水纸上吸干表面水，用灭菌刀将苦杏胚芽切成2毫米左右大小； (3)制作培养基:配方是在I升MS基本培养基上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、VB 6 8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克、琼脂6克；搅拌均匀，为固体培养基，pH为5.8，对固体培养基进行120°C、20分钟蒸汽灭菌，形成湿度较大的无菌固体培养基；
(4)诱导苦杏胚芽愈伤组织:把切好的苦杏胚芽接种在培养基，培养基分装在三角瓶中，每瓶装40毫升培养基，接种10毫克切好的苦杏胚芽；置于培养基温度27°C的条件下，诱导傅伤组织；20天后长出愈伤组织；
(5)继代培养苦杏胚芽愈伤组织:将20天后长出愈伤组织，转移到上述相同的培养基上，每个三角瓶移入5 - 7块初始苦杏胚芽愈伤组织，在1500 L U X A荧光灯的光培养下，每40天继代一次；
(6)挑选苦杏胚芽愈伤组织:经过3- 4次继代培养后的苦杏胚芽愈伤组织，用灭菌针头挑选出生长旺盛、颗粒状的苦杏胚芽愈伤组织；
(7)将挑选出生长旺盛、颗粒状的苦杏胚芽愈伤组织，一部分用于继续继代培养，另一部分用于规模化生产苦杏氰甙；
所述的规模化生产苦杏氰甙的操作方法如下:
(1)将挑选出生长旺盛、颗粒状的苦杏胚芽愈伤组织接种在三角瓶装的液体培养基上，该培养基是在培养基配方为I升无菌水的基础上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、V B 6
8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克，搅拌均匀，进行灭菌处理，而制成的液体培养基；每个为三角瓶装100毫升液体培养基，接种2克鲜重的苦杏胚芽愈伤组织；
(2)将接种后的三角瓶放在往复80— 90次/分钟的摇床上培养，光培养为1500 L UX A荧光灯，温度为27°C，接种后10天为第一继代，按照I瓶扩大为10瓶的数量；要求每个三角瓶装100毫升液体培养基，接种2克左右鲜重的苦杏胚芽愈伤组织的数量，以后每7天继代一次，扩大一次，共计7次；
(3)将苦杏胚芽愈伤组织返回固体培养基，经过7次继代和扩大培养后，将培养苦杏胚芽愈伤组织，放在40毫米X40毫米，高20毫米的灭菌不锈钢盘的原固体培养基上接种，固体培养基厚度在10毫米，放置黑暗条件下，培养20天；
(4)培养20天后的苦杏胚芽愈伤组织和培养基，通过磁力搅拌反应器作用，分离出苦杏胚芽愈伤组织；
(5)将培养的苦杏胚芽愈伤组织烘干，提取苦杏氰甙。
[0009]本发明提供的一种从野生苦杏仁提取氰甙有毒成分，进行工厂化制造无公害制造杀虫剂的方法，利用研制的培养基和植物生长调节剂，对野生苦杏仁胚芽细胞进行悬浮培养，诱导脱分化形成愈伤组织；然后培养愈伤组织变为具有分裂能力的细胞，细胞大量繁殖；收集培养物，提取苦杏仁氰甙；归为有机化合物腈类，是碳和氮两种元素的化合物，结构式N = C-C =，无色带苦杏仁味的剧毒气体，其毒性与HCN相似。可溶于水、乙醇和乙醚，加热至400°C以上聚合成不溶性的白色固体，用于有机合成杀虫剂。
[0010]苦杏仁:杏仁分甜杏仁和苦杏仁。一般说来，栽培杏所产的大多是甜杏仁，野生的则多为苦杏仁；苦杏仁一般用来入药，其毒性比一般甜杏仁高数十倍，从深山老林中寻找野生苦杏树，移来栽培，尽量避免人为干扰，失去野性。
[0011]苦杏仁氰甙:苦杏仁氰甙是苦杏树的次生代谢物，是苦杏树在长期逆境中进化的表现，是通过改变其代谢途径，提高抗病虫害的能力，通过技术测试，苦杏树中杏仁的氰甙含量高，特别是苦杏仁在萌发时，胚芽细胞中氰甙含量最高，是作为种质最理想的细胞株。
[0012]本发明的有益效果:该杀虫剂属植物次生代谢物杀虫农药的优点是，具有杀虫活性，使用中对人畜比较安全，而且还兼有杀菌和刺激作物生长的作用；达到杀虫防病、增产增收的多重功效，主要用于家庭阳台种植的小花园、小菜园的病虫害防治。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:生产苦杏氰甙作为杀虫剂的方法，包括:选择增殖速度快而且细胞内氰甙含量高的苦杏胚芽细胞株作为种质和规模化生产苦杏氰甙两部分；其具体操作方法如下:
所述的选择增殖速度快而且细胞内氰甙含量高的苦杏胚芽细胞株作为种质步骤如下:
(1)取正季生长的苦杏胚芽，作为诱导愈伤组织的外植体，取苦杏胚芽后，注意保鲜和清洁；
(2)苦杏胚芽表面消毒:于150毫升三角瓶中，放自来水60毫升自来水和2-3克洗衣粉，并将苦杏胚芽放入，在轻轻搅动1-1.5分钟；防止苦杏胚芽流掉的前提下，用自来水龙头小水流冲洗2-3小时后，在超净台上小心地用灭菌镊子将苦杏胚芽夹到另一个灭菌三角瓶中；倒入75%的酒精放置I分钟后，倒掉酒精；再倒入0.1%次氯酸钙12 - 15分钟后，倒出次氯酸钙，用灭菌水冲洗3次，再在无菌水中静泡3-4分钟，用灭菌过的镊子将苦杏胚芽夹到吸水纸上吸干表面水，用灭菌刀将苦杏胚芽切成2毫米左右大小；
(3)制作培养基:配方是在I升MS基本培养基上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、VB 6 8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克、琼脂6克；搅拌均