一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞冻存液技术领域，具体设及一种培养后的NKT细胞的冻存液及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 细胞冻存是长期保存维持细胞活性的一种有效方法，其冻存经过低溫冷冻保存和 超低溫冷冻保存两个阶段，低溫冷冻保存可W降低细胞的代谢，而超低溫（-198°C的液氮 中）冷冻保存可W保存活细胞物质代谢和几乎完全停止细胞生长，在超低溫冻存时，调节 和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内的生化反应十分缓慢，甚至停止， 从而保持了细胞的活性。
[0003] 近几年在NKT细胞的表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗 和自身免疫性疾病治疗等方面的研究有了很大的发展。由于NKT细胞在肿瘤及免疫性疾病 治疗等方面的研究，也决定了NKT细胞培养后冻存的重要性，在治疗方面可W避免延时培 养造成的细胞活性低，将最佳状态时期的细胞冻存起来；在经济方面，避免了延时培养造成 的成本增加；在研究方面，将不同时期的NKT细胞冻存起来，研究其不同冻存时间的NKT细 胞活性。
[0004] 但是如果单纯的冻存，在冻存过程中细胞会受到两个方面的损伤：第一，在冻存的 过程中，胞外的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，属于 渗透性损伤；第二，由于低溫导致细胞胞内部形成冰晶会破坏细胞内的结构，属于机械损 伤。因此结合W上两点原因，必须解决冷冻的速度，及冻存剂的配方，复苏时融冻的速度也 直接影响细胞的活性。 阳〇化]细胞冻存液是指用于保护细胞免受冷冻损失的物质，一般可分为渗透性和非渗透 性两类。渗透性冻存液主要是小分子物质，易溶于水，与水分子结合能力强，容易通过细胞 膜进入细胞内，降低细胞的冰点，提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成，从而减小冰晶 的损伤。
[0006] 现有技术中，通常采用添加不同比例的胎牛血清（FB巧和二甲基亚讽值MS0)配制 的冻存液，再进行不同溫度和时间的程序降溫来冻存培养后的NKT细胞，添加DMS0只是为 了从冻存过程中防止胞内冰晶的形成而损伤细胞，而添加FBS是为了保护细胞不受DMS0的 损伤和提供营养，但是FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险， 不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起未知的不良反 应，严重影响治疗结果。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好的保 持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存培养后的NKT细胞。
[0008] 本发明还提供一种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法。
[0009] 本发明通过W下技术方案实现该目的：
[0010] 一种培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液 A和自体血清的体积比为1~3 :1，其中：
[0011] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为1~3:1~3:1~5:1。
[0012] 作为优选的方案，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的 体积比为1~2:1，其中：
[0013] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为1~2:1~2:1~3:1。
[0014] 作为另一优选的方案，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血 清的体积比为2~3 :1，其中：
[0015] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为2~3:2~3:3~5:1。
[0016] 作为优选的，所述香茹多糖的浓度为1~6mg/mU所述海藻多糖的浓度为0. 05~ 0. 2mg/mL。 阳017] -种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法，包括W下步骤： 阳01引 1)将浓度为1~6mg/mL的香茹多糖和0. 05~0. 2mg/mL的海藻多糖分别加入自 体血清中，再缓慢的加入DMS0,按体积比添加香茹多糖：海藻多糖：自体血清：DMS0为1~ 3 :1~3 :1~5 :1，将配审IJ得至IJ的溶液A置于2~S〇C度冰箱预冷，备用；
[0019] 2)再将上述溶液A取出，将其缓慢加入到自体血清中，按体积百分比添加溶液A: 自体血清为1~3 :1，配制成NKT细胞冻存液。
[0020] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的培养后的NKT细胞的冻存液包 括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污 染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的香茹多糖、海藻多糖不仅能够有效的保持细 胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效 果好。
【附图说明】
[0021] 图1为冻存前的NKT细胞形态图。 阳02引 图2为冻存后的对照组的NKT细胞形态图。 阳02引图3为冻存后的实验组1的NKT细胞形态图。
[0024] 图4为冻存后的实验组2的NKT细胞形态图。 阳0巧]图5为冻存后的实验组3的NKT细胞形态图。
[0026] 图6为冻存前后的NKT细胞增殖曲线图。
[0027] 图7为冻存前后的NKT细胞杀伤活性曲线图。
【具体实施方式】
[0028] W下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
[0029] 实施例1、
[0030] 本实施例提供一种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法，包括w下步骤：
[0031] 1)将浓度为1~6mg/mL的香茹多糖和0. 05~0. 2mg/mL的海藻多糖分别加入自 体血清中，再缓慢的加入DMS0,按体积比添加香茹多糖：海藻多糖：自体血清：DMS0为1~ 3 :1~3 :1~5 :1，将配制得到的溶液A置于2~8°C度冰箱预冷，备用；
[0032] 2)再将上述溶液A取出，将其缓慢加入到自体血清中，按体积百分比添加溶液A: 自体血清为1~3 :1，配制成NKT细胞冻存液。 阳〇3引实施例2、
[0034] 本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液 由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :1，其中：
[0035] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为1 :1 :1 :1，其中，香茹多糖浓度为1111旨/111以海藻多糖浓度为 0. 05mg/mL。
[0036] 实施例3、
[0037] 本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液 由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为2 :1，其中：
[0038] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为2 :2 :3 :1，其中，香茹多糖浓度为6111旨/111以海藻多糖浓度为 0. 2mg/mL〇
[0039] 实施例4、
[0040] 本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液 由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为3 :1，其中：
[0041] 所述溶液A包括香茹多糖、海藻多糖、自体血清和DMS0,其中香茹多糖、海藻多糖、 自体血清和DMS0的体积比为3 :3 :3 :1，其中，香茹多糖浓度为3111旨/111以海藻多糖浓度为 0.Img/mL。 柳42] 对比例1、
[0043] 本实施例配制常规细胞冻存液，所述常规细胞冻存液为含有10%FBS的DMS0。 W44] 实施例5、NKT细胞的扩增培养及收集
[0045] 1、外周血单核球的分离
[0046] 1)采集10~80ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1 :1的比例混匀，将混匀 后的血液混合液与淋己细胞分离液按体积比2 :1的比例缓慢的加至淋己细胞分离液上层， 3000巧m离屯、20min;
[0047] 2)离屯、后离屯、管的从上到下看，分别为血浆、白膜层，即单个核细胞层（PBMC)、淋 己细胞分离液、红细胞层，抽取PBMC层，将收集到的PBMC用生理盐水洗涂重悬后，150化pm 离屯、lOmin，重复洗涂两次，收集到P