一种cik细胞冻存液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞冻存领域，尤其涉及一种CIK细胞冻存液。
【背景技术】
[0002] CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-InducedKiller，CIK)，是一种新 型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。CIK细胞杀伤肿 瘤细胞是非MHC限制的，即不受癌症组织类型的限制，能在人体内广泛部位自动识别并杀 伤肿瘤细胞。正常人外周血中CIK细胞数量仅占淋巴细胞数量的1-5%，其数量减少和功能 减弱与肿瘤的发生、发展密切相关。
[0003] 如今，CIK细胞治疗被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细 胞的治疗功能具有以下特点：选择性地杀伤肿瘤细胞、体外增殖快、杀伤活性高、抗瘤谱广、 副作用小。用CIK细胞治疗可以同时结合化疗、放疗，有提高疗效、减轻化疗和放疗的副作 用。对某些不适合手术、放疗和对化疗耐受的中晚期肿瘤或年老体弱肿瘤患者，使用CIK细 胞治疗可以起到改善生活质量、延长生命的作用。
[0004] 然而有些时候，当在进行CIK细胞治疗或保健的过程中，患者因为各种原因而需 要推迟一段时间进行回输，但是细胞已经在体外培养扩增一段时间了，这时候就需要把细 胞暂时甚至长期冻存起来了。而复苏后细胞活力的高低、质量以及复苏后细胞的生长质量 直接影响后续的治疗和保健质量。
[0005] 细胞冻存液是直接影响冻存后细胞活力、质量等的重要因素。现有常规的CIK细 胞冻存液有两种，一种是由DMS0 (二甲基亚砜）、FBS(胎牛血清）和基础培养基按体积比 1:2:7配制而成，另一种是由DMS0与FBS按体积比1:9配制而成。使用上述冻存液冻存的 CIK细胞复苏后活率低，而且表面抗原丢失严重，影响治疗效果；此外，上述冻存液中FBS用 量大，成本偏高。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种CIK细胞冻存液。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种CIK细胞冻存液，包含DMS0、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白和FBS。
[0009] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：
[0010]
[0011] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：
[0012]
[0013] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：
[0014]
[0015] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：
[0018] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：
[0019]
[0020] 优选地，将葡萄籽提取物、棉籽糖用PBS分别配制成葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶 液，使用葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液配制CIK细胞冻存液。
[0021] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：
[0022]
[0023] 进一步优选地，所述葡萄籽提取物溶液的浓度为20mg/ml，所述棉籽糖溶液的浓度 为 50mg/ml〇
[0024] 优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：
[0025]
[0026] 棉籽糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，在大部 分的植物中都存在，它也被称为蜜三糖、棉子糖等。棉籽糖可以延长细胞的存活期。葡萄籽 提取物是从葡萄籽中提取的一种人体内不能合成的新型高效天然抗氧化剂物质。它是目前 自然界中发现的抗氧化、清除自由基能力最强的物质，其抗氧化活性为维素E的50倍、维生 素C的20倍。在本发明CIK细胞冻存液中葡萄籽提取物主要起抗氧化作用，可以提高细胞 免疫功能。
[0027] DMS0可以防止细胞破裂，降低细胞内水的熔点，防止形成晶体。人血白蛋白占血浆 胶体渗透压的80%，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。在本发明中人血白蛋白可 以维持细胞内外渗透压平衡。FBS是细胞培养基和冻存液的常用成分，可以为细胞提供营养 成分。
[0028] 与现有技术相比，本发明CIK细胞冻存液具有如下有益效果：
[0029]针对常规细胞冻存液存在的缺陷，本发明改进细胞冻存液的配方，添加了棉籽糖、 葡萄籽提取物和人血白蛋白，棉籽糖可以延长细胞的存活期，葡萄籽提取物具有抗氧化作 用，能够保护结构组织不被自由基破坏，进而起到保护细胞的作用，人血白蛋白可以维持细 胞内外的渗透压平衡，改进后的细胞冻存液更适合CIK细胞的冻存。
[0030] 本发明CIK细胞冻存液能够很好的保持细胞活力，减少细胞表面抗原的丢失；使 用本发明冻存的CIK细胞在复苏后还具有良好的增殖能力和杀伤活性。
【附图说明】
[0031] 图1为复苏后CIK细胞增殖曲线图。
【具体实施方式】
[0032] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法第都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
[0033]本发明CIK细胞冻存液包含DMS0(购自上海前尘生物科技有限公司）、葡萄籽提取 物（购自湖北众诚科技有限公司）、棉籽糖（购自郑州裕和食品添加剂有限公司）、人血白 蛋白（购自郑州莱士血液制品有限公司）和FBS(购自上海素尔生物科技有限公司）。
[0034] 为了便于下文中本发明CIK细胞冻存液的描述和配制，在各实施例和对比例中， 棉籽糖和葡萄籽提取物均用PBS配制成溶液后再用于配制的本发明CIK细胞冻存液。葡萄 籽提取物溶液的浓度为20mg/ml，其配制方法为：称取0. 5g葡萄籽提取物溶于25mlPBS中， 搅拌至完全溶解，放4°C冰箱保存备用。棉籽糖溶液的浓度为50mg/ml，其配制方法为：称取 lg棉籽糖溶于20mlPBS中，搅拌至完全溶解，放4°C冰箱保存备用。
[0035] 实施例1
[0036] 把0. 5mlDMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、1ml棉籽糖溶液以及2ml人血白蛋白缓慢 加入5. 5mlFBS中，混合均匀后放入4°C冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMS0、葡萄籽 提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5%、10%、10%、20%和 55 %，葡萄籽提取物的含量为2mg/ml，棉籽糖的含量为5mg/ml。
[0037] 实施例2
[0038] 把1mlDMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、2ml棉籽糖溶液以及1. 5ml人血白蛋白缓慢 加入4. 5mlFBS中，混合均匀后放入4°C冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提 取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为10 %、10 %、20 %、15 %和 45%，葡萄籽提取物的含量为211^/1111，棉籽糖的含量为1〇1^/1111。
[0039] 实施例3
[0040] 把1mlDMS0、0. 5ml葡萄籽提取物溶液、1. 5ml棉籽糖溶液以及1ml人血白蛋白缓 慢加入6mlFBS中，混合均匀后放入4°C冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMS0、葡萄籽 提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为10%、5%、15%、10%和 60%，葡萄籽提取物的含量为111^/1111，棉籽糖的含量为7.51^/1111。
[0041] 实施例4
[0042] 把0. 5mlDMS0、0. 5ml葡萄籽提取物溶液、1ml棉籽糖溶液以及1ml人血白蛋白缓 慢加入7mlFBS中，混合均匀后放入4°C冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMS0、葡萄籽 提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5%、5%、10%、10%和 70%，葡萄籽提取物的含量为111^/1111，棉籽糖的含量为51^/1111。
[0043] 实施例5
[0044] 把0. 5mlDMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、2ml棉籽糖溶液以及1. 5ml人血白蛋白缓 慢加入5mlFBS中，混合均匀后放入4°C冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMS0、葡萄籽 提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5%、10%、20%、15%和 50%，葡萄籽提取物的含量为211^/1111，棉籽糖的含量为1〇1^/1111。
[0045] 对比例1
[0046] 把1mlDMS0和2mlFBS加入7mlRPMI1640培养基中，混合均匀后放入4°C冰箱保 存备用。本对比例冻存液中DMS0、FBS和RPMI1640培养基体积百分含量分别为10%、20% 和 70%〇
[0047] 对比例2
[0048] 把lmlDMSO加入9mlFBS中混合均匀，放入4°C冰箱保存备用。本对比例冻存液中 01^0和？83的体积百分含量分别为10%和90%。
[0049] 对比例3
[0050] 本对比例中细胞冻存液，含有下述重量体积百分数的下述组分：棉子糖6%、DMS0 10%、维生素C0.2%、甲基纤维素4000CP5%、羟乙基淀粉5%、谷氨酰胺1 %、丙酮酸钠 0. 2 %，新生牛血清74. 6 %。按常规方法配制，放入4°C冰箱保存备用。
[0051] 对比例4
[0052] 本对比例中冻存液含有下述重量体积百分数的下述组分：棉子糖20%、DMS0 10 %、维生素C10 %、FBS60 %。按常规方法配制，放入4°C冰箱保存备用。
[0053] 效果实施例1、冻存CIK细胞的复苏活性检测
[0054] 本发明冻存液可以用于冻存任何方法诱导的CIK细胞。本实施例中CIK细胞具体