一种胆木无菌苗的诱导培养基及胆木脱毒快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组培快速繁殖技术领域，更具体地，涉及一种胆木无菌苗的诱导培养 基及胆木脱毒快繁方法。
【背景技术】
[0002] 胆木（TVai/cJea /Yerre)为茜草科乌檀属植物乌檀，以其枝、干、树皮 等部位入药，具有清热解毒、消肿止痛等功效，是胆木浸膏片、胆木注射液等中成药的主要 原料，其被广泛应用于乳腺炎、急性扁桃体炎，咽喉炎，支气管炎，肠炎，胆囊炎、肺炎，泌尿 系感染等症的治疗。由于胆木为重要的医药原料，野生资源破坏严重，采集野生资源已经不 能满足生产需要，开展规范化生产是解决药材短缺的有效途径，而种苗繁育是规范化生产 的重要组成部分，由于胆木果实成熟周期较长，种子成熟度不一，加上种子狭小，种皮坚硬， 休眠期长，导致胆木种苗繁育周期较长，苗木供应紧张，远远不能满足市场的需要，这使胆 木在我国境内的推广栽培和资源利用受到了极大的限制。
[0003] 利用植物组织培养技术建立胆木脱毒快繁体系是生产优质胆木优质种苗的有效 途径，现有技术中有关胆木组培苗生产中都以胆木种子为外植体，阐述了胆木组培方法，其 主要包括外植体消毒、丛生苗的诱导、生根和炼苗移栽等环节，从技术而言，其都属于胆木 组培脱毒快繁体系，但是其体系中增殖培养基由6-BA和NAA组成，无法有效改善胆木无菌 种子苗繁育中存在的出苗周期长、出苗率低等问题，在增殖培养中由于缺乏椰子乳等有机 物质和TDZ等高效生长素，亦无法克服胆木组培中存在的繁殖效率低、年繁殖种苗数量有 限等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述问题，首先提供一种胆木 无菌苗的诱导培养基。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种胆木无菌苗的增殖培养基。
[0006] 本发明的第三个目的是提供一种胆木无菌苗的生根培养基。
[0007] 本发明的第四个目的是提供一种胆木脱毒快繁方法。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种胆木无菌苗的诱导培养基，包括含有0. 1~10. 0%有机添加物、0. 05~0. 2 mg/L DA-6的3/4 MS培养基。
[0009] 优选地，所述有机添加物选自椰子水、胡萝卜泥、土豆泥。
[0010] 更优选地，所述诱导培养基是含质量浓度为10%的椰子水和0. 1 mg/L DA-6的3/4 MS培养基。
[0011] 优选地，当在诱导培养基中添加0. 05~0. 5mg/L 6六3时，可以进一步提高无菌苗 的出苗率，缩短出苗时间，此时含有6六3的诱导培养基的pH值为5. 6~6. 0。
[0012] 本发明还提供一种胆木无菌苗的增殖培养基，是在所述诱导培养基的基础上添加 0. 05~1. Omg/L 6-BA、0. 05~0. 1 mg/L的NAA ;或者是在权利要求1所述诱导培养基的基 础上添加0. 05~1. 0 mg/L TDZ ;此时增殖培养基的pH值为5. 6~6. 0,视种苗需求数量可 增殖25~30d。
[0013] 更优选地，所述增殖培养基中6-BA浓度为0. 5mg/L，NAA浓度为0. lmg/L ;或者所 述增殖培养基中TDZ浓度0. lmg/L。
[0014] 本发明还提供一种胆木无菌苗的生根培养基，是在所述诱导培养基的基础上添加 0· 1%~1. 0%的活性炭或0· 05~0· 1 mg/L的NAA ;此时生根培养基的pH值为5. 6~6. 0。
[0015] 本发明还提供一种胆木的脱毒快繁方法，包括以下步骤： 51. 将无菌的胆木种子接种于诱导培养基中，培养至无菌苗的长度为0. 5~1. 0 cm ; 52. 将无菌苗切割成带有1个顶芽或1~2个腋芽、且长度为1. 0~2. 0 cm的茎段后 接种于增殖培养基中培养； 53. 待长出微枝长度为2.0~3.0 cm，接种于生根培养基中进行生根培养； 54. 将胆木苗进行室内炼苗后移栽至培养基质中完成胆木的脱毒快繁。
[0016] 优选地，上述步骤SI、S2、S3所述培养条件为温度为25~28°C、湿度为70%~80%、 光照强度为80~100 lx、光照8~10 h/d。
[0017] 优选地，S3在生根培养基中培养至生根长度为1. 5~2. 0 cm。
[0018] 具体地，S4所述炼苗时将生根培养的胆木苗于隐蔽度为15%~20%的荫棚，炼苗 7 ~10 d 〇
[0019] 优选地，S4所述培养基质为10%~15%蛭石，10%~15%牛粪，10%~15%椰糠和 55% ~70% 土壤。
[0020] 优选地，S1所述无菌的胆木种子的获得过程为：将清洗后的胆木果实外植体在超 净工作台上用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡30~60s，然后用无菌水冲洗3~5次，再用 质量浓度为〇. 1%的氯化萊(含1%吐温)溶液消毒7~15min，然后用无菌水冲洗3~5次， 将种子从消毒后的果实外植体中剥离出即得。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种胆木无菌苗的诱导培养基及胆木脱毒快繁方法，所述诱导培养基包 括含有〇. 1~10. 〇%有机添加物、〇. 05~0. 2 mg/L DA-6的3/4 MS培养基；还通过优化脱 毒方法、优化无菌苗培养、增殖培养和生根培养程序，建立了胆木的脱毒快繁方法；与传统 繁殖方法相比，具有省工省时省地，成本低，繁殖率高(增殖系数> 30代/年)、出苗率高、繁 殖时间短、成活率高（> 95%)的优点，有效解决了胆木种苗繁育中存在的繁殖周期长、繁殖 效率低、种子苗出苗率低、移栽成活率低、种苗繁育成本高等问题，实现了胆木种苗繁育过 程的快速高效、低成本、生长繁育周期不受季节及树龄限制等目的，为胆木种苗的工业化生 产的奠定了基础。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换， 均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。
【具体实施方式】 [0023] 中，污染率是指接种lOd后被细菌或真菌污染的外植体瓶数占总接 种瓶数的百分率；褐化率是指接种l〇d后外植体褐化变黑的瓶数占总接种瓶数的百分率； 增殖率是指接种l〇d后外植体开始生长的瓶数占总接种瓶数的百分率；月增殖系数是指接 种30d后，与原接种量相比，增殖的倍数百分率。
[0024] 实施例1胆木外植体消毒程序优化 本实验所用为2014年4月~7月在海南省儋州、五指山、白沙、海口等市县采收的胆木 (Λ^?/cJea ο/Λ?/Μ?·? Pierre)果实为实验材料。
[0025] 将胆木果实分为6组，用75%酒精消毒30~60s后、升汞(质量浓度0. 1%，含1%吐 温)消毒7~15min，无菌水漂洗5次至pH=7,重复3次，置于30°C恒温培养箱全光照培养， 于10~12d后统计污染率与增殖率。
[0026] 实验如表1所示，（1)控制升汞消毒时间为lOmin，考察75%酒精消毒时间对消毒 效果的影响，结果表明：当升萊消毒时间为l〇min，30s、45s和60s的酒精消毒对胆木果实的 消毒效果影响不大，其污染率在30±3%，增殖率在30%±3% ; (2)控制酒精消毒时间为30s， 考察0. 1%升汞消毒时间对消毒效果的影响，结果表明：当酒精消毒时间为30s，消毒效果随 升汞消毒时间的递增而愈好，其中控制酒精消毒时间为30s，0. 1%升汞消毒时间为12min， 其污染率15±2%，增殖率为38%±2% ;酒精消毒时间为30s，0. 1%升汞消毒时间为15min，其 污染率12±2%，增殖率为36%±2%。
[0027] 因此确定胆木果实的最佳消毒程序为：75%酒精消毒30s，0. 1%升汞消毒时间为 12min，其污染率在15 ±2%，增殖率为38 ±2%。
[0028] 实施例2培养基筛选及优化 本实施例中所有的培养基都含有3.0%质量浓度的蔗糖；所用的3/4 MS培养基、1/2 MS 培养基都是将大量元素的浓度降低至1/2、3/4,其他成分保持不变所得到的培养基。
[0029] 将种子从消毒的胆木果实中剥离出，将消毒后的胆木种子分别接种于MS培养基、 3/4 MS培养基、1/2 MS培养基、改良培养基1 (丽Sp 3/4MS培养基+10%的椰子水)、改良培 养基2 (丽S2,3/4MS培养基+10%胡萝卜泥)、改良培养基3 (丽S3,3/4MS培养基+10% 土豆 泥)、改良培养基4 (MMS4, 3/4MS培养基+10%的椰子水+0. 05 mg/L的DA-6)、改良培养基5 (MMS5, 3/4MS 培养基 +10% 椰子水 +0. 10mg/L DA-6)、改良培养基 6(MMS6, 3/4MS 培养基 +10% 椰子水+0. 2 mg/L DA-6)，然后在全自动光照培养箱，控制培养条件为：温度25~28°C，湿 度70%~80%，光照强度80~100 lx，光照8~10 h/d，观测种子的出苗时间和生长状况。
[0030] 结果如表2所示，在MS培养基上，胆木种子于47d开始出苗，出苗周期持续30d， 植物生长较弱小，于接种后120d可达0. 5~1. 0 cm ;在3/4 MS培养基上，胆木种子于50d 开始出苗，出苗周期持续20d，胆木植株粗壮，但生长较缓慢，于接种后120d可达0. 5~1. 0 cm ;在1/2 MS培养基上，胆木种子于48d开始出苗，出苗周期持续20d，胆木种苗根系细长， 植株纤细，长势较弱，生长较缓慢，于接种后120d可达0. 5~1. 0 cm ;在附加了 10%的椰子 乳、土豆泥、胡萝卜泥等的改良培养基（丽Si、丽S2和丽S3)上，在一定程度上改善了胆木种 苗纤细、生长缓慢等劣势，但效果不是非常明显；以附加了 10%的椰子乳的改良培养基为基 础，在附加了 0. 05~0. 20 mg/L的DA-6改良培养基（丽S4、丽S5和丽S6)有效缩短了胆木 出苗时间，提高了胆木生长状况，其中尤以MMS5改良效果最