一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选抗衰老药物的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 21世纪是人口老龄化的世纪，人口老龄化将带来一系列非常严重的医学和社会问 题[1]，面对庞大的老年群体，要从根本上提高他们的生存质量，就要找到改善身体机能、延 缓衰老的方法。从中医药和化合物库中筛选和开发可预防及治疗衰老相关疾病、延长寿命 的安全有效的抗衰老药物，逐渐成为今后我国新药研制的热点。
[0003] 学界认为衰老机制在生物之间是进化保守的，现阶段国内外抗衰老药物筛选选用 的模型主要有细胞、果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠和大鼠。细胞为模型的药物筛选为体外药物 作用研究，效率高但往往相关性差；果蝇的生活模式限制了其在高通量药物筛选中的应用； 斑马鱼在衰老方面由于培养条件和发育时间的问题应用有所限制 [2];鼠类的建模实验操作 技术要求高且因其培养条件高和寿命周期长导致筛选效率低、研究成本高昂[3]。而秀丽隐 杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌（E.coli);世代周期短， 通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，而且可以大 量获得同步化(生长时期处于同一阶段）的秀丽隐杆线虫。秀丽隐杆线虫因为寿命周期短 和容易实现高通量的优势，成为衰老研究的理想模型 [4]。但是现阶段，尚未出现基于上述秀 丽隐杆线虫模型的筛选抗衰老药物的试剂盒，供本领域研发人员高效准确地筛选抗衰老药 物。
[0004] 对此，本发明特提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，使用该试剂盒能够快速准确 地筛选抗衰老药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法。
[0005] 此外，在筛选化合物的抗衰老药效时，寿命分析实验均采用固体NGM培养基。但 是，NGM培养基会随着水分蒸发逐渐干燥，涂在培养基表面的大肠杆菌0P50也会随着秀丽 隐杆线虫的取食逐渐消耗殆尽，秀丽隐杆线虫会因失水或饥饿影响其正常寿命。同时，在筛 选化合物的抗衰老药效时，研究者在寿命分析实验普遍采用在秀丽隐杆线虫生育期每天转 板、生育期结束后2飞天转板一次直至寿命实验的结束 [5'6]，或者每天转板直至秀丽隐杆线 虫全部死亡[7'8]。然而该方法由于频繁转板会对秀丽隐杆线虫，尤其是衰老秀丽隐杆线虫造 成机械损伤，导致秀丽隐杆线虫非自然死亡，进而影响寿命。以上缺陷均会给所筛药物的抗 衰老药效分析增加影响因素。
[0006] 并且，频繁转板也会带来其他问题，诸如药物用量大、人工工作量大、容易污染等。
[0007] 因此，本发明基于上述问题，提供了一种使用特殊结构的秀丽隐杆线虫专用培养 皿的试剂盒，省去了秀丽隐杆线虫培养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，简化 培养过程，节约成本，方便操作，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。
[0008] 【1】苏柳竹.我国人口老龄化研究及应对措施[J]，科技故事博览：科教创 新，2011，（5) :198-198. 【2】贾熙华，曹诚.秀丽隐杆线虫在医药学领域的应用和进展[J]，药学学报， 2009, 44(7) : 687. 【3】杜艳，吴海标.动物衰老模型及艾灸抗衰老实验研究进展[J]，广西中医学院 学报，2008，11(003) : 88-90. 【4】OlsenA,VantipalliMC,LithgowGJ.UsingCaenorhabditiselegansasa modelforagingandage-relateddiseases.AnnNYAcadSci, 2006, (5) : 120-8 【5】D.Srivastava,U.Arya,T.SoundaraRajanetal.Reserpinecanconfer stresstoleranceandlifespanextensioninthenematodeC.elegans[J],Biogerontolo gy，2008, 9: 309-316.
[6]AndersOlsen,M.C.Vantipalli,G.J.Lithgow.Lifespanextension ofC.elegansfollowingrepeatedmildhormeticheattreatments[J], Biogerontology, 2006, 7:221-230. 【7】尹大强，于振洋，胡霞林等.用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方 法·中国.200810207706.X[P]· 2009-12-25. 【8】于笑坤，何潇潇，付学奇，马俊峰。水溶性人参皂苷对秀丽隐杆线虫生物学功能的 影响【J】，吉林大学学报，2012, 7, 50 (4) :812-814.。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出抗 衰老药物。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种无需转板的筛选抗衰老药物的试剂盒，该试剂盒 能够避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析 实验的结果的问题。同时，减少培养过程大肠杆菌0P50和无菌水的添加频率，简化培养过 程，节约成本，方便操作。 本发明的另一个目的是提供上述筛选抗衰老药物的试剂盒的使用方法。
[0011] 本发明提供一种筛选抗衰老药物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下试 剂： ① 、试剂A:秀丽隐杆线虫； ② 、试剂B:NGM培养基； ③ 、试剂C:大肠杆菌0P50 ; ④ 、试剂D:氟脲苷； ⑤ 、试剂E:无菌水。
[0012] 其中，所述秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20ul，大肠杆菌0P50的浓度为10mg/ ml,氟脲苷的浓度为50μΜ,无菌水的体积为50-100μL。
[0013] 所述秀丽隐杆线虫为同步化线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用Μ9缓冲液 将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上 清；加入裂解液，终浓度：3. 2%NaCIO和1MNaOH;在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的 虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫 卵；M9缓冲液冲洗两次，加入lmlM9缓冲液，置于20°C培养箱中孵化48小时。
[0014] 所述试剂盒还含有秀丽隐杆线虫专用培养皿，该培养皿皿盖为环形镂空形状，镂 空部位覆盖有封口膜，培养皿中加有NGM培养基。
[0015] 所述试剂C为含有大肠杆菌0P50活菌的冻干粉或菌液。
[0016] 本发明还提供上述筛选抗衰老药物的试剂盒的使用方法： (1) 将含有待测药物的溶液与NGM培养基混匀，倒入秀丽隐杆线虫专用培养皿中，制板 待用，NGM培养基中含有浓度为50μΜ的氟脲苷，其中，空白组使用等量无菌水替换含有待 测药物的溶液； (2) 将L4期同步化的秀丽隐杆线虫，用钼丝挑针转移到各药物组和空白组的秀丽隐杆 线虫专用培养皿中，药物组为含有不同浓度待测药物的NGM培养基，每个药物浓度三个平 行，每平行板25~30条秀丽隐杆线虫，置于20°C培养，每天观察并计数秀丽隐杆线虫存活 数和死亡数； (3) -周后培养皿开始干燥，秀丽隐杆线虫开始出现皮肤略显皱缩、状态不活跃、行动 略缓，菌斑镜下观察已接近无菌等缺水、缺大肠杆菌0Ρ50表现，此时在无菌超净台中打开 皿盖，用移液器加入定量无菌水50-100μL和大肠杆菌0Ρ50 20-50μL，10mg/mL;加完后静 置，待水和菌皆渗入NGM培养基中将培养基正置，用封口膜封皿，重置20°C培养箱培养； 约一周又出现干燥和缺菌状态，重复上述补充水分和菌的操作，补充无菌水需持续到整个 寿命实验结束，而补充大肠杆菌0P50视具体情况，25-30条秀丽隐杆线虫约需补充2次； (4) 用挑针轻触，秀丽隐杆线虫无反应则判定为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻 到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除； (5) 采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均 寿命显著高于空白组则证明药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证药物不 具有抗衰老活性，以此评价药物的抗衰老活性。
[0017] 本发明的有益效果： 1、本发明提供一种基于秀丽隐杆线虫模型的筛选抗衰老药物的试剂盒，该试剂盒检测 结果准确，使用方法简单，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。
[0018] 2、本发明所述试剂盒使用特殊结构的秀丽隐杆线虫专用培养皿，使用该培养皿能 够在减少NGM培养基中水分蒸发的同时，保证秀丽隐杆线虫生存所需的氧气，同时减少无 菌水和大肠杆菌0P50的添加频率，补加水以1周为周期，补加菌以1周为周期，重复过程直 至寿命实验结束，使培养过程更简便，延长NGM培养基的使用时间。省去了秀丽隐杆线虫培 养过程中因为NGM培养基损耗带来的转板过程，避免因为频繁转板使秀丽隐杆线虫受到机 械损伤造成非自然死亡，进而影响寿命分析实验结果的问题；同时解决因为频繁转板带来 的诸如药物用量大、人工工作量大、容易污染等其他问题。
[0019] 以下提供具体实施例以实现本发明所述的筛选抗衰老药物的试剂盒，但不限于这 些实施例。
【具体实施方式】
[0020] 实验生物： 秀而隐杆线虫早衰模型株系TK22,购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 秀而隐杆线虫正常株系N2,购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 细菌株：尿啼陡渗漏突变型大肠杆菌0P50,购买于TheCaenorhabditisGenetics Center(CGC)。
[0021] 培养基： NGM培养基：NaClL5g，K2HP04L3g，ΚΗ2Ρ04 8 . 5g，蛋白胨L4g，琼脂粉 8. 5g，蒸馏水 500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇（5mg/ml，无水乙醇配制)，高压蒸汽灭菌的 50〇μL1mol/LMgS04, 500μLlmol/LCaCl2〇
[0022] M9 缓冲液：NaCl1. 98g，Na2HP04 2 . 38g，ΚΗ2Ρ04 1. 20g，MgS04 0· 048g，蒸馏水 400mL。
[0023]LB液体培养基