获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业微生物领域，具体涉及获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法。
【背景技术】
[0002]小麦矮腥黑粉菌，即小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa KUhn，TCK)，属真菌界黑粉菌科腥黑粉菌属，是引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一。
[0003]小麦矮腥黑粉菌的形态特征如下:冬孢子堆多生于子房内，形成黑粉状的孢子团，即黑粉菌癭，每个菌癭视大小不同可含有冬孢子10万至100万个。冬孢球形或近球形，黄褐色至暗棕褐色，其平均直径及标准差为20.90+/-0.72，大多为19-23um，但偶有17um或30um的(包括胶鞘)。外孢壁的多角形网眼状饰纹，网眼通常直径3-5um，偶尔呈脑纹状或不规则形，肉脊平均高度为1.425+/-0.144um，孢壁外围有透明胶质鞘包被，不育细胞球形或近球形，无色透明或微绿色，有时有胶鞘，直径通常小于冬孢子9-16um，偶尔可达22um，表面光滑，孢壁无饰纹。
[0004]小麦矮腥黑粉菌的生物学特性如下:小麦矮腥黑穗病菌冬孢子萌发，需持续低温，大体上在3°C _8°C之间，而以4-6°C为最适温度，最低为0°C，最高为10°C。当温度为4_6°C时，在光照条件下，冬孢子通常经3-5周后萌发，个别菌株在第16天开始萌发，少数菌株经7-10周后才开始萌发。高于或低于适温范围，孢子萌发时期相应延长，在0°C左右，孢子经8周后才开始萌发，并生成正常的先菌丝及孢子和次生小孢子。当10°C时，孢子在8周后开始萌发，多生成细长、畸形的先菌丝，很少形成小孢子，并常有自溶现象。病原冬孢子有极强的抗逆性，在室温条件下，其寿命至少为4年，有的长达7年，病癭中的冬孢子，在土壤中的寿命为3-7年，分散的冬孢子则至少一年以上，病菌随同饲料喂食家畜后，仍有相当的存活力。病原冬孢子耐热力极强，在干热条件下，需经130°C半小时才能灭活，而湿热则需80°C、20分钟可致死。
[0005]在对小麦光腥黑粉菌的侵染机制的研究中，通常需要通过人工方法将它接种至小麦植株使后者感染得到染病小麦植株以进行观察和分析，现有技术中存在一些人工接种的方法，例如，易建平等创建的胚芽鞘创伤单孢接种法，即用无菌手术小刀划伤萌发种子的胚芽鞘顶部，切取约4?5mm2带有单个萌发TCK冬孢子的琼脂小块，反贴于胚芽鞘伤口处，每株麦苗接种I个萌发孢子。接种麦苗置于5°C光照(12h/d)条件下培养。以及胚芽鞘单孢接种法，即用无菌手术小刀切取约4?5mm2带有单个萌发TCK孢子的琼脂小块，反贴于胚芽鞘上，每株麦苗接种I个萌发孢子。接种麦苗置于5°C光照(12h/d)条件下培养。经这两种人工接种方法获得的小麦植株发病率分别为4.44%和0.44%。2014年姚卓等人分别用4种不同的人工接种方法对小麦光腥黑粉菌对小麦种子进行系统侵染，只有第一种和第三种方法获得了 3.33%和6.66%的发病病穗。
[0006]本领域上缺乏一种仅针对部分孕穗的部分籽粒进行侵染的人工接种方法。
【发明内容】
[0007]本发明针对上述领域存在的空白，提供了一种通过人工接种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株方法。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]—种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0010](I)制备萌发的冬孢子悬浮液:培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子至萌发，将萌发后的冬孢子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02%的吐温，制得冬孢子悬浮液；
[0011](2)培养小麦植株:将小麦种子灭菌催芽后进行春化处理，将春化后的小麦种子栽种于灭菌土里至孕穗期；
[0012](3)接种:将所述冬孢子悬浮液注射进小麦穗子最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘内。
[0013]步骤(I)中所述的培养指，用2%土壤浸提液培养基，在5°C人工气候生长培养箱培养内全光照倒置培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子15天。
[0014]所述冬孢子悬浮液的浓度为100X 14?105X 10 4个/ml,每穗小麦的注射量为IML0
[0015]所述小麦种子灭菌催芽，以30% NaClO溶液对小麦种子表面消毒5min，无菌水冲洗5次后，将小麦种子浸种催芽，直至胚芽鞘长至I?3_。
[0016]所述春化处理指，催芽后的小麦种子分散平铺在培养皿盖中的湿滤纸上，封口膜密封，置于5°C的培养箱中，4周低温春化处理，直至苗长至3?5cm。
[0017]步骤(2)中所述培养的条件是，全天25°C，相对湿度50%，全光照处理，隔夜浇水一次。
[0018]所述孕穗期指，在步骤(2)所述培养的条件下小麦植株生长30天至株高25?35cm，叶片长至7叶。
[0019]任一所述的方法在小麦矮腥黑粉菌研究方面的应用。
[0020]本发明提供了一种人工接种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，包括如下步骤:
[0021](I)制备萌发的冬孢子悬浮液:培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子至萌发，将萌发后的冬孢子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02%的吐温，制得冬孢子悬浮液；这样制备的冬孢子悬液具有符合接种条件的悬浮浓度，加入0.02%的吐温是为了对冬孢子起到保护作用。
[0022](2)培养小麦植株:将小麦种子灭菌催芽后进行春化处理，将春化后的小麦种子栽种于灭菌土里至孕穗期；对小麦种子灭菌以及采用灭菌土栽培的作用是防止其它病菌的干扰以保证用于待侵染的小麦植株在接种前是无菌的；春化处理的作用是为了保证小麦植株后期能顺利孕育结实。
[0023](3)接种:将所述冬孢子悬浮液注射进小麦穗子最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘内。采用这种方式接种可以达到仅使部分穗粒感染的目的。
[0024]步骤(I)中所述的培养指，用2%土壤浸提液培养基，在5°C人工气候生长培养箱培养内全光照倒置培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子15天。这种培养条件和培养环境下获得的萌发的冬孢子可产生有侵染能力的侵染丝有利于获得符合接种条件的冬孢子悬液。
[0025]所述冬孢子悬浮液的浓度为100X 14?105X 10 4个/mL。该浓度下的冬孢子悬液用于接种更优。
[0026]所述小麦种子灭菌催芽指，以30% NaClO溶液对小麦种子表面消毒5min，无菌水冲洗5次后，将小麦种子浸种催芽，直至胚芽鞘长至I?3mm。30 %次氯酸钠溶液对小麦种子消毒的目的在于杀灭小麦种子本身携带的各种病菌，以确保接种前的小麦种子是无菌的。胚芽鞘长至I?3mm的种子更适于后期的栽种。
[0027]所述春化处理指，催芽后的小麦种子分散平铺在培养皿盖中的湿滤纸上，封口膜密封，置于5°C的培养箱中，4周低温春化处理，直至苗长至3?5cm。经过此春化处理步骤的小麦种苗能确保后期发育成有孕育活性的麦穗。
[0028]步骤⑵中所述培养的条件是，全天25°C，相对湿度50%，全光照处理，隔夜浇水一次。这样的培养条件更适于小麦快速健康的生长，可短时间内获得孕穗期小麦株。
[0029]所述孕穗期指，在步骤(2)所述培养的条件下小麦植株生长30天至株高25?35cm,叶片长至7叶。在小麦植株长至这个时期更有利于进行本发明的接种以获得部分病穗及部分病粒。
[0030]本发明还请求保护所述方法在小麦矮腥黑粉菌研究方面的应用。
[0031]经验证统计，采用本发明所述的方法人工接种小麦矮腥