禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及禾谷类作物单株来源小抱子连续培养高频再生植 株方法。
【背景技术】
[0002] 小抱子离体培养技术是目前发展起来的一种重要单倍体育种技术，在多种植物中 都已开展游离小抱子培养，但高频再生体系的建立还仅限于大麦、油菜、烟草、小麦等作物。 陆瑞菊（陆瑞菊，大麦游离小抱子培养技术的优化及单倍体耐盐、耐低氮胁迫筛选体系的 建立巧]，南京农业大学，2012年）等W大田种植大麦Olordeum VUlgareL.)材料为供体 植株，建立了高效的小抱子再生体系，但由于大田环境复杂、受天气等影响较大，供体植株 生长条件难W控制，并且只能在当季获得小抱子培养供体材料，取材（幼穗）受季节性限 审IJ。溫室种植可在很大程度上克服大田种植的局限，提供稳定一致的生长环境，并且可W人 为调节光、溫、水、肥等生长条件，使供体植株处于最佳生长状态。
[0003] 小抱子培养阶段结合高盐、低氮等胁迫培养，可W在小抱子培养的早期阶段进行 基因重组体的筛选与纯合，从而减少育种选择的强度和工作量，大大提高育种效率（黄剑 华等，2003 ;黄剑华，2007 ;万光龙，2007)。利用单株来源小抱子连续培养，可W长时期开展 离体小抱子的胁迫培养，并且使多世代的小抱子连续胁迫培养成为可能，提高定向选择的 稳定性。
[0004] 对种子或离体小抱子进行理化诱变，结合小抱子培养可W获得耐逆性提高的育种 材料（顾宏辉等，2003 ;程芳芳，2014 ;陆瑞菊等，2014 ;王亦菲等，2014)。利用理化措施对 单株来源的小抱子进行诱变，可W获得单株（或单粒种子）起源遗传背景完全一致的性状 纯合的再生植株，是进行遗传突变分析的理想材料，目前还未见利用大麦等禾谷类作物单 株来源的小抱子开展诱变和培养工作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是改进已有大麦等禾谷类作物小抱子培养流程，提供一种W室内种 植单株为供体材料，利用单株持续分葉实现游离小抱子连续培养的方法。
[0006] 本发明第一方面提供一种单株起源的小抱子培养方法，包括从禾谷类作物的幼穗 中分离出小抱子，并对分离出的小抱子进行愈伤诱导和分化的步骤，其中，所述从禾谷类作 物的幼穗中分离出小抱子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分葉孕穗的同一株禾谷类 作物获取中部小花小抱子发育处于单核早-中期的幼穗，W对每次获取的幼穗实施所述分 离、愈伤诱导和分化步骤。
[0007] 本发明第二方面提供一种由禾谷类作物单株来源小抱子培养获得再生植株的方 法，包括从禾谷类作物的幼穗中分离出小抱子，并对分离出的小抱子进行愈伤诱导和分化， W及将分化获得的再生苗培养成再生植株的步骤，其中，所述从禾谷类作物的幼穗中分离 出小抱子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分葉孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小 花小抱子发育处于单核早-中期的幼穗，W对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分 化和培养步骤。
[0008] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，在W下条件进行室内种植：光照强度 1500~2500山，光照时间10~1611/天，湿度60%~80%，光照时室溫20~25°(：，黑暗时 室溫16~22 °C。
[0009] 在一个具体实施例中，在W下条件进行室内种植：光照20001X，光照时间12h/天， 湿度70%，光照时室溫22°C，黑暗时室溫18°C。
[0010] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，选取所述禾谷类作物中部小花小抱子发 育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部1~2.0cm。
[0011] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，获取中部小花小抱子发育处于单核 早-中期的幼穗后，保湿条件下于0~8°c放置10~30天。
[0012] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述分离包括：将幼穗的花巷加到提取 液中，超速旋切，过滤，从而分离得到小抱子。
[0013] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，分离获得小抱子后，将分离到的小抱子 加到提取液中，于室溫（例如23~28°C)、黑暗中放置18~28小时后，纯化小抱子。
[0014] 在一个具体实施例中，所述提取液为55~65g/L甘露醇，1.0~1.2g/L化C12、 0. 960~0. 985g/LMES(2- (N-吗啡嘟）乙横酸）和15~30mg/L秋水仙碱，pH5.6~6. 0 ; 优选 60g/L的甘露醇，1.Ig/LCaCl2、〇. 976g/LMES和 20mg/L秋水仙碱，pH5.8。
[0015] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，将纯化的小抱子加到愈伤诱导培养基中 进行愈伤诱导，其中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70~ llOg/L麦芽糖、0. 3 ~0.6mg/LKT、0.8~1. 2mg/L2, 4-D、0. 960 ~0. 985g/LMES、300 ~ 500mg/L水解干酪素和1400~1800mg/L谷氨酷胺，抑为5.6~6. 0。
[0016] 在一个具体实施例中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添 加有 90g/L麦芽糖、0. 5mg/LKT、1.0mg/L2,4-D、0. 976g/LMES(2-(N-吗啡嘟）乙横酸）、 400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酷胺，P册.8。
[0017] 在一个具体实施例中，在室溫（如23~28°C)、黑暗条件下进行愈伤诱导15~25 天，优选18~21天。
[0018] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，愈伤诱导结束后，将获得的愈伤组织转 移到分化培养基，诱导分化形成再生苗。
[0019] 在一个具体实施例中，分化培养基为2/3MS，添加20~40g/L的麦芽糖、0. 3~ 0. 7mg/L的6-BA、1. 3 ~1. 7mg/L的KT、0. 03 ~0. 07mg/L的NAA和 4. 5 ~6. 5g/L的琼脂， 抑为5.6~6.0。
[0020] 在一个具体实施例中，分化培养基为2/3MS，添加30g/L的麦芽糖、0. 5mg/L的 6-BA、1. 5mg/L的KT、0. 05mg/L的NAA、5. 5g/L的琼脂，pH5.8。
[0021] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，待分化的再生苗长至2~4cm时将其转 移至壮苗培养基。
[0022] 在一个具体实施例中，壮苗培养基为1/2MS，添加20~40g/L的麦芽糖、0. 03~ 0. 07mg/L的NAA、3. 0 ~5.Omg/L的多效挫和 4. 5 ~6. 5g/L的琼脂，pH为 5.6~6. 0。
[0023] 在一个具体实施例中，壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的麦芽糖、0.05mg/L的 NAA、4.Omg/L的多效挫和5. 5g/L的琼脂，pH为5. 8。
[0024] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，再生苗转至壮苗培养基后，至再生苗长 3~5cm时，取出洗净根部培养基，然后置于清水中漂苗2~3天。
[0025] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，漂苗结束后，加入化agland溶液，水培 5~15天，至根长5~10cm。
[0026] 在一个具体实施例中，所述化agland溶液的配方如下：0. 1~0. 3mM NH4NO3,4~ 6mM KN03, 1 ~SmM Ca (N03)2,1 ~SmM MgSO" 0. 05~0. 15mM KHzPO" 0. 3~0. 07mM NazSiOs, 0.03~0.07mM NaFe(III) - EDTA，0.008~0.012mM H3BO3,0.003~0.007mM MnClz， 0. 003 ~0.007mMZnS〇4,0.0003 ~0.0007mMCuS〇4,0.00008 ~0. 00015mlNazMoOs，使用前 将其抑值调节至5.8~6.2。
[0027] 在一个具体实施例中，所述Hoagland溶液的配方如下：0. 2mMNH4N03, 5mMKN03， 2mMCa(N〇3)2,2mMM拆〇4,0.ImM皿2口〇4,0. 5mMNa2Si〇3,0. 05mMNaFe(III) -EDTA'O.OlmM H3B〇3,0.005mMMnCl2,0.005mMaiS〇4,0.0005mMCuS〇4,0.OOOlmM胞21〇〇3,使用前溶液抑值 用稀盐酸调节至6.0左右。
[0028] 在本发明第二方面的一个具体实施例中，所述方法还包括：将所获得的再生植株 室内种植，并从其不断分葉孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小抱子发育处于单核 早-中期的幼穗，对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分化和培养，W获得下一代 植株。
[0029] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，在所述愈伤诱导培养基中添加400~ 800mg/L的化Cl或将所述愈伤诱导培养基的N6基本培养基中的氮含量降低为0. 5~ 1. 5mM，对小抱子形成愈伤组织过程中进行盐胁迫或低氮营养胁迫。
[0030] 在一个具体实施例中，盐胁迫或低氮营养胁迫后，将所得愈伤组织在所述分化培 养基中分化成苗，将所得再生苗经倍性鉴定后实施所述壮苗，然后转移到盆鉢，在人工气候 室种植获得幼穗，直接作为下一代小抱子培养供体植株。
[0031] 在本发明上述方面的一个具体实施例中，分离获得小抱子后，将分离到的小抱子 加到提取液中，在提取液中加入化学诱变剂，于室溫（例如23~28°C)、黑暗中放置18~ 28小时后，纯化小抱子，其中，所述提取液为55~65g/L、优选60g/L的甘露醇，添加1. 0~ 1. 2g/l、优选 1.Ig/L的CaCl2,〇. 960 ~0. 985g/L、优选