步骤二:将P2代脐带血干细胞团完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去离子水的混合溶液中，维持温度在3.5°C的条件下，在次声波振荡频率为10Hz的条件下加入8.5%的渗透性保护液，1%的单糖，17%的不含纤维蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ -球蛋白，2.1%的Rho抑制剂，其余组分为生理盐水，Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔1:1:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存。
[0045]实验冻存材料:脐带血干细胞实验方法:
按上述四个步骤冻存干细胞24h后，
步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波(频率为8~13Hz)振荡条件下加入17%的不含纤维蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，
0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ；
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0046]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0047]实验结果:测得复苏率为94.3%
实施例5
一种低冷冻损伤的干细胞冻存方法，包括以下几个步骤:
步骤一:抽取脐带血，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.3X104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代；
步骤二:将P2代脐带血干细胞团完全浸泡在8.4%的渗透性保护液，0.9%的单糖，17%的不含纤维蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，2.3%的Rho抑制剂，其余组分为生理盐水，Rho抑制剂为Y-27632和羟基法苏地尔2:1的混合物，继续在次声波条件下振荡45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存。
[0048]实验冻存材料:脐带血干细胞实验方法:
按上述四个步骤冻存干细胞24h后，
步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波(频率为8~13Hz)振荡条件下加入17%的不含纤维蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，0.8%~1%的单糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ；
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0049]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0050]实验结果:测得复苏率为94.9%
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于包括以下几个步骤: 步骤一:抽取脐带血，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.3X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代； 步骤二:将P2代脐带血干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，17%的不含纤维蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液； 步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ; 步骤四:存入液氮罐中保存。2.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述次声波的频率为8~13Hz。3.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述渗透性保护液为DMS0和聚乙二醇的混合溶液。4.如权利要求1或3所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述渗透性保护液为43%的DMS0和57%的聚乙二醇。5.如权利要求4所述的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的冻存保护剂，其特征在于:所述DMS0的浓度为0.34-0.37g/mL。6.如权利要求4所述的一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的冻存保护剂，其特征在于:所述聚乙二醇的浓度为0.53-0.55g/mL。7.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述单糖为葡萄糖和果糖的混合溶液。8.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。9.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，其特征在于:所述Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法，属于干细胞冻存领域。本发明的一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法包括抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO2的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.3×104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代等四个步骤。本发明具有在冷冻过程中对冻存细胞低细胞毒性损伤，低保护剂渗透性损伤，同时避免形成冰晶引起机械损伤，提高冻存细胞复苏率的特点。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105394028
【申请号】CN201510777329
【发明人】黄林海
【申请人】黄林海
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月16日