一种茶树组织培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于茶树组织培养技术领域，具体设及一种茶树组织培养的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，茶树(Camellia sinensis L.Kuntze.)属山茶科，山茶属，是一种多年生的 木本、常绿植物。茶树组织培养技术的研究起源于20世纪60年代末，英国剑桥大学W茶树幼 茎小块为材料研究了离体咖啡碱的合成。50年来中外科学家在茶树组织和器官培养领域做 出了不懈的努力，在快速繁殖、植株再生和遗传转化、次生代谢产物等许多方面获得了进 展。但不容否认，茶树组织培养还有不少难题未攻克，主要有污染、褐化、玻璃苗、难W分化、 再生体系不完善等等。其中，因为茶树多酪类物质含量高，褐化现象严重，阻碍了组培的后 续工作。因此，研究一种降低褐化率，提高茶树组织培养效率的方法为本领域目前迫切需要 解决的技术难题。
【发明内容】
[0003] (一)要解决的技术问题
[0004] 本发明要解决的技术问题是解决由于茶树多酪类物质含量高，褐化现象严重的问 题。
[000引（二)技术方案
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种茶树幼叶组织培养的方法，包括如下 步骤：
[0007] -种茶树幼叶组织培养的方法，其特征在于:包括如下步骤：
[000引（1)取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
[0009] (2)将所述外植体依次用酒精消毒和次氯酸钢消毒；
[0010] (3)将消毒后的外植体沿垂直于叶脉的方向横切数刀且不切断；
[0011] (4)将所述外植体接种于经过灭菌后的液体培养基，再放入培养室中进行培养;所 述液体培养基的pH值为5.4-5.8，具体组成为:MS+4. Omg/L 6-BA+1. Omg/L IBA+薦糖30g，再 转接到固体培养基暗培养。
[0012] 优选的，所述步骤2中用酒精消毒和次氯酸钢消毒后，分别W无菌水进行冲洗，本 发明中用70%-80%的酒精消毒5-lOs，无菌水冲洗1遍，每次l-2min;用8%-12%次氯酸钢 消毒10-15m i n，无菌水冲洗4遍，每次1 -2m i n。
[0013] 优选的，将所述消毒后的外植体沿垂直叶脉方向横切5-8刀，根据外植体大小，一 般情况下沿垂直于叶脉的方向横切5-8为最佳刀数，所述外植体在切割时，叶缘0.5-lcm处 不切断，切割后的外植体为一整片完整样本。
[0014] 优选的，所述外植体接种于装有50ml培养基的250mL培养瓶中，每瓶接种5~6片所 述外植体，优选250mL的培养瓶，太大容量的培养瓶浪费材料，变向提高成本;每个培养瓶中 放置5~6片所述外植体，由于在外植体培养成功后，其培养瓶中优选放置5~6片所述外植 体，若太少，培养液浪费，若太多，会因为空间狭小导致新苗放置空间不足。
[0015] 优选的，所述步骤4中所述培养具体为:将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d 后转接到固体培养基暗培养，转接到固体培养基暗培养时，由于培养时间的变化，褐化率与 萌芽率均发生变化。
[0016] 所述暗培养条件:溫度22-25°C;所述光培养条件为:溫度22-25°C，光照强度1500-200化X，光照时间12h/d，暗培养与光培养培养总时间25d。
[0017] (;巧益效果
[0018] 本发明的上述技术方案具有如下优点:本发明公开了一种茶树幼叶组织培养的方 法，其方法是将茶树幼叶外植体消毒后将茶树幼叶接种于不含琼脂的液体培养基上，每瓶 接种6个沿垂直叶脉方向横切5-8刀的茶树幼叶，接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体 培养基上暗培养12d，过运种方法处理过的外植体褐化率为32%，萌芽率高达68% ;本发明 利用液固共培养和暗培养相结合的办法，明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显 著提高萌芽率和效率。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明实施例茶树幼叶组织培养的方法的流程示意图；
【具体实施方式】
[0020] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人 员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021] 实施例1
[0022] 本发明实施例提供的茶树幼叶组织培养的方法，其步骤如下；
[0023] 取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
[0024] 将茶树幼叶用70%的酒精消毒10s，无菌水冲洗1遍；用10%次氯酸钢消毒15min， 无菌水冲洗4遍；
[0025] 将每个茶树幼叶沿垂直叶脉方向横切5-8刀，所述外植体在切割时，叶缘0.5-lcm 处不切断；
[0026] 将上述叶片接种在不含琼脂的液体培养上，每个瓶子接种6片茶树幼叶，接种后放 入培养室中进行培养。
[0027] ^培养基为:15+4111旨/16-84+1.〇111旨/1184+薦糖30旨+琼脂粉7旨，9巧直调至5.8，配 制好的50ml培养基装在250mL培养瓶中，高溫灭菌25min。
[0028] 外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基暗培养4d。培养条件为： 溫度22-25°C，光照强度1500-2000LX，光照时间12h/d，培养总时间20d。褐化率降为47.8%， 萌芽率达到52.2%。
[0029] 实施例2到8
[0030] 根据固体培养基暗培养时间的变化，得到W下数据。
[0031]
[0032] 由上述实验数据得知，在暗培养条件:溫度22-25°C;光培养条件为:溫度22-25°C， 光照强度1500-200化X，光照时间12h/d，暗培养与光培养培养总时间25d的情况下固体培养 基暗培养时间为ll-13d的效果相对较好，萌芽率较高，固体培养基暗培养培养时间12d为最 佳。
[0033] 实施例9
[0034] 本发明实施例提供的茶树幼叶组织培养的方法，其步骤如下；
[0035] 取生长健壮的嫩绿色茶树幼叶为外植体；
[0036] 将茶树幼叶用70%的酒精消毒10s，无菌水冲洗1遍；用10%次氯酸钢消毒15min， 无菌水冲洗4遍；
[0037] 将每个茶树幼叶沿垂直叶脉方向横切5-8刀，所述外植体在切割时，叶缘0.5-lcm 处不切断；
[0038] 将上述叶片接种在不含琼脂的液体培养上，每个瓶子接种6片茶树幼叶，接种后放 入培养室中进行培养。
[0039] ^培养基为:15+4111旨/16-84+1.〇111旨/1184+薦糖30旨+琼脂粉7旨，9巧直调至5.8，配 制好的50ml培养基装在250mL培养瓶中，高溫灭菌25min。
[0040] 优选的，所述步骤4中所述培养具体为:将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d 后转接到固体培养基暗培养，转接到固体培养基暗培养12d，在其通过固体培养基暗培养 12d后，转到